弓形虫基因工程疫苗研究的新进展

王培园，李 结，朱兴全，袁子国*

（1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州 730046；2.华南农业大学兽医学院，广东广州 510642）

弓形虫病是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种呈世界性分布且严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，能够感染包括几乎所有哺乳动物和一些鸟类。据不完全统计，全世界约有三分之一成年人感染弓形虫。绝大多数弓形虫感染呈隐性感染，不表现临床症状，但对于器官移植、恶性肿瘤及艾滋病等免疫抑制及免疫功能缺陷者，弓形虫是重要的致命因子之一。孕妇感染弓形虫、不仅容易导致流产、早产、死胎和胎儿畸形，而且可以通过垂直传播，导致胎儿或婴儿发育畸形、智力障碍、脑膜炎甚至死亡等临床症状，弓形虫感染被认为是导致畸宫内感染综合症的首要病因[1]。

由于弓形虫的生活史和致病机理比较复杂，到目前为止，尚无治疗弓形虫病的理想药物，因此，使用安全有效的疫苗接种被认为可能是预防弓形虫病的最佳预防措施[2]。近年来，弓形虫基因工程疫苗研究已成为热点。目前在弓形虫疫苗候选抗原分子的鉴定、基因克隆及表达等方面开展了广泛研究，其疫苗的研究取得了迅速进展。本文就近年来弓形虫基因工程疫苗的研究现状及进展作一综述。

1 亚单位疫苗

亚单位疫苗是从病原中分离的一个或几个具有免疫原性的抗原决定族表位制成的蛋白质疫苗[3]，近年来常用于研究弓形虫亚单位疫苗的候选抗原主要有：表面抗原SAG1（P30）、棒状体蛋白 ROP1、ROP2，致密颗粒蛋白GRA1及微线体蛋白M IC3等。

Liu等采用重组狂犬病病毒表达的Tg SAG1蛋白免疫BALB/c小鼠，小鼠对弓形虫RH株和狂犬病病毒均产生了较好的免疫性[4]。Ismael等研究显示M IC3是一种黏附性蛋白，能够成为一种重要的抗弓形虫病的候选疫苗因子[5]。尽管亚单位疫苗安全性要比传统灭活和减毒疫苗免疫效果好，但免疫原性较弱，不能被抗原递细胞系统（APCS）有效识别、呈递。

2 核酸疫苗

核酸疫苗是将编码病原生物的某种抗原基因的重组质粒直接接种机体，核酸进入机体细胞内，表达编码的抗原，激活免疫系统产生抵抗病原侵入或致病的免疫力。相比传统疫苗，核酸疫苗可诱发机体全面免疫应答、能够联合免疫，制备多价疫苗且制备简单，成本低廉，便于储存和运输。核酸疫苗的候选目的基因主要为编码表面抗原（SAG）、棒状体蛋白（ROP）、微线体蛋白（M IC）及致敏颗粒蛋白（GRA）等。

2.1 表面抗原（SAG）核酸疫苗 表面抗原即弓形虫速殖子表面膜蛋白。弓形虫表面抗原家族庞大，主要包括SAG1、SAG2、SAG3、SAG4等。在弓形虫不同的生活阶段，其表面抗原也不完全相同。弓形虫的表面抗原虽然复杂多样，但其蛋白序列的总体结构大致相似[6]。

Ma等对弓形虫速殖子可溶性抗原进行分析，表明了包括SAG1在内的11个蛋白具有抗原性和免疫原性，并认为这些蛋白可以作为抗弓形虫疫苗的候选抗原[7]。Shang等用pVAX/TgSAG1首免，重组病毒rPRV/TgSAG1加强免疫，结果显示：免疫组小鼠存活时间明显延长（15.44±5.0 d），存活率达40%，而对照组小鼠在11 d内全部死亡[8]。而通过酵母菌分泌表达载体pPICZaαA表达的SAG2基因表达的22 ku蛋白产物，经腹腔免疫BALB/c小鼠后能够诱导产生特异性抗SAG2抗体[9]，表明SAG2具有一定的免疫原性。

2.2 棒状体蛋白（ROPs）核酸疫苗 弓形虫棒状体蛋白是由棒状体所分泌的对弓形虫侵入宿主细胞起重要作用的蛋白质。目前研究较多的棒状体蛋白是ROP1和ROP2。ROP1基因是一个单拷贝基因，ROP2则是一个非常大的蛋白家族，主要包括 ROP2、ROP3、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP16和ROP18等。

Dziadek等用大肠杆菌表达的重组ROP2和ROP4免疫C3H/He J小鼠，表明两种重组抗原均能够诱导产生系统性Thl和Th2型免疫反应，两者对弱毒DX株弓形虫的攻击感染均能够提供部分保护，免疫组脑组织中包囊数量可减少46%[10]。Yuan等用构建的pVAX-ROP16真核表达质粒接种小鼠后，可以诱导产生细胞免疫与体液免疫应答，RH株攻虫感染结果显示：免疫组小鼠存活时间明显延长（21.6±9.9 d），表明ROP16具有较好的免疫原性，可以作为弓形虫疫苗的候选分子[11]。同时pVAX-ROP18真核表达重组质粒接种小鼠后，同样也能够诱导强烈的T细胞免疫反应，而且免疫组小鼠存活时间明显延长（27.9±15.1 d）[12]。

2.3 微线体蛋白（MIC）核酸疫苗 微线体是位于弓形虫前部的分泌器官，所有微线体蛋白都是在粗面型内质网中合成，再经高尔基体加工后到达微线体，最后分泌到虫体外。目前已知的微线体蛋白有15种以上，包括M IC1-M IC12、AMA1、Tg-SUB1、TgSUB2等。

Fang等将M IC3基因克隆至“自杀式”载体（Suicidal vector）pSCA1，并比较pSCA/M IC3和传统真核表达载体疫苗pcDNA/M IC3的免疫保护性，两者分别免疫BALB/c小鼠后两组小鼠的抗M IC3蛋白特异性抗体滴度、淋巴细胞体外增殖反应的刺激指数和IFN-γ的表达水平均比对照组明显增高（p<0.05），而且免疫组小鼠的存活时间均比对照组显著延长[13]。以pVAX-M IC6真核重组表达质粒接种小鼠后，可以诱导产生细胞免疫与体液免疫应答，淋巴细胞体外增值反应的刺激指数和IFN-γ、IL2、IL4及IL10的表达水平均比对照组明显增高（p<0.05），结果显示免疫组小鼠存活时间明显延长（13.3±1.2 d），表明M IC6具有较强的免疫原性[14]。此外，采用pcDNA-M IC8免疫昆明鼠，结果显示可诱导产生细胞免疫与体液免疫应答，免疫鼠经腹腔注射RH株弓形虫速殖子，免疫组小鼠的平均存活时间较对照组显著延长（10.3±0.9 d）[15]，表明M IC8也属于良好的弓形虫疫苗候选抗原。

2.4 致密颗粒蛋白（GRA）核酸疫苗 致密颗粒蛋白是弓形虫侵入宿主细胞后纳虫泡后不久，由弓形虫的另一类细胞器一致密颗粒释放的内容物。目前已报道的致密颗粒蛋白约有13种，包括GRA1～GRA9、三磷酸核苷水解酶的同工酶NTPaseI和NTPaseⅡ、蛋白酶的抑制剂等。

Golkar等利用重组GRA2蛋白和佐剂单磷酰脂质A（MPL）免疫CBA/J小鼠后，能够诱导产生高比例的IgG2a/IgG1特异性抗体，脾细胞体外经分泌——排泄抗原刺激后产生大量的IFN-γ和IL-2。经腹腔接种弓形虫包囊后，免疫组小鼠脑中包囊数明显少于对照组[16]。证明重组GRA2能够有效抵抗弓形虫慢性感染。陈媛媛等通过原核细胞表达的GRA3能够被弓形虫阳性血清识别，具有较好的免疫反应活性[17]。Chen等利用脂质体包裹重组质粒pcDNA/GRA4，肌肉注射免疫C57BL/6小鼠后。经口感染80个ME49株包囊，结果显示脂质体组小鼠的生存率达到72.7%，单独接种重组质粒组的生存率为54.5%，而空质粒对照组小鼠全部死亡[18]。表明GRA4具有良好的抗弓形虫感染的活性。

2.5 复合基因疫苗 复合疫苗是利用多个不同抗原的蛋白疫苗或编码基因构成的核酸疫苗的组合，制成不同形态的多种抗原成分为基础的多肽或多基因疫苗，该疫苗能够有效弥补单价疫苗的不足，增强免疫效果，提高保护率。

Wang等采用SAG1和M IC4制成的多抗原DNA疫苗，能够显著激发BALB/c小鼠体液免疫和细胞免疫，提高小鼠的存活率[19]。Xue等构建了 pcDNA3.1-SAG1-ROP2-GRA2多抗原疫苗，并用IL-12作为佐剂增强其免疫效果，经肌肉免疫BALB/c小鼠后观察其免疫效果[20]。结果显示该重组质粒比单独表达SAG1、ROP2、GRA2的重组质粒免疫产生的体液免疫和Th1型细胞免疫反应更强烈，并且以IL-12为佐剂可以提高免疫效果，显著延长小鼠的存活时间。Cui等构建了重组质粒pSAG1-ROP2-SAG2，并以p IL-12作为佐剂做比较，分别免疫BALB/c小鼠发现，有p IL-12的诱导的体液免疫和Th1型免疫明显强于没有 p IL-12组[21]。Yan等利用构建的pVAX/PLP1（穿孔素样蛋白）真核表达质粒免疫小鼠，再用弓形虫RH株速殖子感染小鼠。结果显示pVAX/PLP1免疫组和pVAX/PLP1+pVAX/IL-18联合免疫组小鼠可有效地诱导产生体液免疫和细胞免疫反应，小鼠平均存活时间显著延长[22]。并且pVAX/PLP1+pVAX/IL-18联合免疫组免疫效果明显优于pVAX/PLP1组，表明pVAX/IL-18是一个较好的分子免疫佐剂，能够有效增强免疫效果。

3 多表位疫苗

多表位疫苗是利用基因重组技术将不同抗原分子设计成联合抗原或将编码不同抗原分子的功能性表位氨基酸的基因片段串连，在宿主细胞内利用真核启动子来持续高效表达多个多肽类免疫原，从而给宿主免疫系统以持续的、多层次的刺激，可以显著提高免疫效率，这类疫苗针对性强、安全性高，是一个新的发展趋势。

史霖等构建成含SGA1、GRA1、GRA4和GRA2多个T、B细胞表位的弓形虫DNA疫苗。以该多表位DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，然后进行RH株弓形虫攻击感染保护实验，结果显示该疫苗可以诱导产生特异性的体液及细胞免疫应答，免疫小鼠存活期显著延长[23]。谭逵等采用生物信息学方法对弓形虫新基因WX2进行表位分析预测，利用编码2个表位的片段W 2a和W2b构建新基因双表位疫苗pcDNA3-W 2a2b免疫小鼠，弓形虫攻击感染试验结果显示，双表位疫苗组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组和单表位疫苗，而且小鼠存活时间显著延长[24]。Cong等将已知的弓形虫主要抗原SAG1、GRA1、ROP2和GRA4的表位串联起来构建了多表位疫苗，以霍乱毒素的亚基A2/B（CTXA2/B）作佐剂，RH强毒株攻毒免疫BALB/c小鼠，结果显示诱导产生了显著的体液和细胞免疫，并且以CTXA2/B作为分子佐剂可提高免疫应答强度和小鼠存活率[25]。

4 病毒活载体疫苗

近年来，重组病毒载体介导外源基因表达提供更为安全可靠的载体渠道，以病毒载体为基础构建的重组活载体疫苗成为弓形虫基因工程疫苗研究领域的热点。

A lexandre等构建含弓形虫SAG2基因的重组腺病毒Ad-SAG2免疫小鼠，能够有效诱导SAG2细胞内表达，诱导产生特异性抗体，经弓形虫P-Br株包囊感染后，免疫鼠组织中包囊数量减少85%[26]。Erica等通过构建含弓形虫SAG1基因的rAd腺病毒rAd-SAG1免疫小鼠，可以诱导产生细胞免疫与体液免疫应答，其IFN-γ和IL12的表达水平均比对照组明显增高（p<0.05），攻虫试验表明，免疫鼠能有效抵抗弓形虫感染[27]。此外，Nie等分别构建重组伪狂犬病毒rPRV-SAG1和rPRV-M IC3免疫BALB/c小鼠，可以诱导产生强烈的细胞免疫与体液免疫应答，其IFN-γ和IL2的表达水平均较对照组明显增高（p<0.05），rPRV-SAG1和rPRV-M IC3免疫组在攻虫后的存活率分别为 33.3%和 50%[28]。

5 存在的问题及展望

目前弓形虫基因工程疫苗的研究显示，尽管它们能够诱导产生一定的保护作用，但仍然存在一些问题，比如大多数单个抗原疫苗诱导的免疫保护效果十分有限，免疫效果不够理想，同时也存在生产过程复杂，技术难度大及成本高等缺点，尤其是对RH强毒株的致死性攻击感染还不能获得完全保护。这可能与核酸疫苗的免疫原性、转化效率以及能否持续表达有关。因此，在今后弓形虫疫苗的研究中，还应着重于对弓形虫保护性抗原的进一步深入研究，继续筛选相对保守、抗原性更强的疫苗候选分子，从而避免株间的免疫保护差异。选择合适的分子佐剂也十分重要，需要更加深入的研究。此外，免疫方式、接种以及评估体系的建立也有待于作进一步探索。随着生物信息学和基因工程技术的不断发展，对弓形虫保护性抗原和免疫机制研究的不断深入，弓形虫疫苗的研制势必将会取得重大突破，并在控制人和动物弓形虫病方面发挥重要作用。

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