活猪携带猪瘟病毒检测方法比较

胡 杰，梁 媛，莫胜兰，张步娴，施开创，屈素洁，粟艳琼，陆文俊，苏 凯，李 军

（广西动物疫病预防控制中心，广西南宁530001）

猪瘟（Classical swine fever，CSF ）是由黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种急性、热性、接触性传染病，可感染各年龄的猪，一年四季都可流行，发病率和病死率均很高，由于其发生频繁，危害大，流传分布广泛，至今仍是世界防控的主要动物疫病之一。CSFV的检测方法包括常规病毒分离鉴定、兔体交互免疫试验、ELISA、荧光抗体染色法和RT-PCR等，特别是随着分子生物学技术的发展，对CSFV的检测方法发展很快，出现了套式PCR、一步法RT-PCR、多重RT-PCR、实时荧光定量PCR等方法［1-8］，但这些方法在基层很难大面积推广应用，尤其是养殖企业在人员、设备、技术等方面存在着较大差异，还是倾向于使用荧光抗体法、ELISA等快速、简单易操作的检测技术。这些方法在猪瘟的诊断上各有优缺点，但各方法间的具体差异没有详细资料，CSFV检测方法进行比较的资料有桂祎等［9］用RT-PCR与ELISA试验比较，张朝红等［10］用病毒分离鉴定、荧光抗体法、RT-PCR和夹心ELISA 4种方法检测23份病料的比较；王向鹏等［11］用病毒分离、胶体金免疫层析试纸条、抗原捕捉ELISA、RT-PCR、TaqMan荧光定量 RT-PCR（RT-qPCR）和反转录-环介导等温扩增（RTLAMP）等6种方法，分别对50份疑似猪瘟病料中的CSFV进行检测；袁雪梅等建立了SYBR Green和TaqMan探针的两种荧光定量PCR检测方法，并进行比较［12］。上述资料多数是对病死猪进行检测，还未见有资料对活猪的不同样品间的差异进行比较。本试验对猪的全血、血清、扁桃体和精液4种不同样品用CSFV糖蛋白ErnsELISA、RT-PCR、CSFV抗原ELISA、荧光抗体染色法4种方法进行检测比较，观察不同样品的检测差异及不种方法之间的复合性、重复性等特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 分别采集广西贵港和横县2个猪场的母猪全血、血清和扁桃体样品各20份和40份，要求所有样品一一对应，并于1个月后再次采集上述样品；同时采集2个场的种公猪精液各15份，并于1个月后再次采集1次，两次采集的样品进行相同方法检测。

1.1.2 试剂 CSFV糖蛋白ErnsELISA试剂盒、CSFV抗原ELISA试剂盒购自北京爱德士世纪元亨有限公司，批号分别为172-480，433902-3320；蛋白酶K为Merxk公司的产品；MiniBEST viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.3.0购自宝生物工程（大连）有限公司；凝胶电泳试剂，6×Loading buffer，昆明云科生物技术有限公司产品；dNTPs、M-MLV RTase、Taq 酶，Promega 公 司 产 品；DL Marker 2 000，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.1.3 引物合成 参照文献［13］设计，其根据GenBank数据库经典毒株NS3基因序列设计，引物序列为上游引物P1：5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′，下游引物P2：5′-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3′，对猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株、猪瘟病毒石门系强毒株均能扩增出508bp目的片段，而对牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）则不能扩增出片段，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.1.4 对照毒株来源 猪瘟病毒兔化弱毒株由广西生物制品厂提供，猪瘟病毒石门强毒株种毒由广西兽医研究所惠赠；BVDV Oregon C24V株，购自中国兽药监察所。阳性样品对照包括猪瘟病毒阳性扁桃体、阳性全血样品、公猪精液均为本实验室从猪瘟发病猪场分离、保存；猪瘟阳性血清购中国农业科学院自兰州兽医研究所，批号为20110312。

1.2 方法

血清样品进行CSFV糖蛋白ErnsELISA检测，扁桃体样品进行荧光抗体、CSFV抗原ELISA和RT-PCR检测，全血样品和公猪精液进行CSFV抗原ELISA和RT-PCR检测。

1.2.1 CSFV糖蛋白 Erns（gp44／48）ELISA检测方法 按试剂盒说明书进行。

1.2.2 荧光抗体染色法 由中国兽医药品监察所完成。

1.2.3 CSFV抗原ELISA方法 按试剂盒说明进行测定。

1.2.4 RT-PCR方法

1.2.4.1 样品RNA抽提 按TaKaRa RNA／DNA抽提试剂盒说明进行抽样。

1.2.4.2 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）过程取16μLRNA与1μL的下游引物（25pmol／μL）混匀，于PCR仪中70℃5min、90℃5min后，立即放入冰浴中5min；再在上液中加入如下试剂：5×buffer 5μL，dNTP（2.5mmol／L）4μL，Rnasin 0.5μL，M-MULV Reverse Transcriptase 0.5μL，置PCR仪中42℃反转录1h后于-20℃保存备用；再进行PCR扩增，体系为50μL，其中灭菌去离子水34μL，10×buffer 5μL，dNTP（2.5mmol／L）4μL，cDNA4 μL，P1（25pmol／μL）1 μL ，P2（25pmol／μL）1 μL， Taq DNA polymerase（5μ／μL）1μL，按如下程序扩增 ：94 ℃ 预变性10min；94℃1min，53℃1min，72℃1min 30s，35个循环；72℃ 延伸10min。PCR产物用10g／L琼脂糖凝胶电泳并拍照。

2 结果

2.1 2个场母猪3种样品（扁桃体、全血、血清）检测结果

从检测方法差异上看，第1次检测时，荧光抗体染色法、CSFV糖蛋白ErnsELISA、CSFV ELISA、RTPCR 4种检测方法在贵港和横县2个场3种样品的检测结果完全吻合的数量分别为15份和2份，吻合率分别为37.50%（15／40）、10.00%（2／20）；第2次检测时，2个场3种样品结果完全吻合的数量分别为21份和7份，吻合率分别为52.50%（21／40）和35.00%（7／20）。若不考虑荧光抗体染色法，2个场3种样品第1次检测时在CSFV糖蛋白ErnsELISA、CSFV ELISA、RT-PCR 3种方法结果完全吻合的数量分别为19份和12分，吻合率分别为47.33%（19／40）和60.00%（12／20），说明荧光抗体染色法与CSF糖蛋白ErnsELISA、CSFV ELISA、RT-PCR存在较大差异，后3种方法有比较高的吻合率（表1和表2）。

从样品类别来看，扁桃体的检出率最高，其次是全血样品，最低是血清；但从RT-PCR、CSFV抗原ELISA方法和CSFV糖蛋白 Erns（gp44／48）ELISA 3种方法看，全血样品的检出率高于扁桃体（表1和表3）。

表1 贵港猪场母猪检测结果Table 1 The detection result of sow in Guigang pig farm

表2 横县猪场母猪检测结果Table 2 The detection result of sow in Hengxian pig farm

表3 2次检测结果汇总Table 3 Summary of detection results in two tests

从检出阳性率看，4种检测中荧光抗体染色法中扁桃体检出率最高为75%；其次是用RT-PCR方法，全血样品平均检出率为38.75%，扁桃体为35%；CS-FV抗原ELISA方法检出率第3，全血样品平均检出率为23.13%，扁桃体平均为22.50%；CSFV糖蛋白Erns（gp44／48）ELISA检出率最低，血清平均检出率为19.38%（表3）。

从检测的重复性看，CSFV抗原ELISA的检测方法重复性最高，扁桃体和全血平均吻合率分别为87.50%和96.25%%；RT-PCR方法第2，扁桃体和全血平均吻合率分别为75.13%和77.50%；CSFV糖蛋白ErnsELISA方法最低，平均吻合率为71.25%；CSFV抗原ELISA和RT-PCR方法中均是全血样品重复性高于扁桃体 （表4）。

表4 不同方法2次检测吻合率汇总Table 4 Summary of detection result using different ways in two tests

2.2 2个猪场公猪精液的检测结果

用CSFV抗原ELISA和RT-PCR方法2次检测2个场的种公猪精液均是RT-PCR方法检出率高于CSFV抗原ELISA方法，其中贵港场检出率分别是40.00%和33.33%，横县场检出率分别是33.33%和26.67%（表5）。

表5 2个场种公猪精液检测结果Table 5 The detection result of swine semen in two farms

2.3 RT-PCR的检测结果

从图1和图2可以看出，标准石门强毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株均能扩增出约508bp目的片段，而BVDV、生理盐水未扩增出相应片段，为阴性，检测样品中2、3、4、10也均能扩增出与标准石门强毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株相同的目的片段，为阳性；检测样品5、6未能扩增出任何片段，为阴性。

图1 猪瘟病毒RT-PCR检测结果Fig.1 CSFV RT-PCR detection results

图2 猪瘟病毒RT-PCR检测结果Fig.2 CSFV RT-PCR detection results

3 讨论

本试验中扁桃体的检出率最高，其次是全血样品，血清样品最低。4种方法中荧光抗体敏感性最高，RT-PCR方法的敏感性次之，CSF抗原ELISA方法敏感性第3，重复性最好，CSFV糖蛋白ErnsELISA敏感性最低。这几种方法各有优缺点。荧光抗体法对实验人员和仪器有一定要求，过去临床诊断中多推荐采用CSFV荧光抗体检测法，该方法需活体取扁桃体，操作复杂，易出现非特异性荧光，对结果判定人员的素质要求相对较高。扁桃体是猪的免疫器官，采集后猪不愿吃食，出现掉膘，所以不建议采用荧光抗体法；RT-PCR方法不能区分是疫苗株和野毒感染，对操作人员要求较高，还要专门的仪器，同时易出现假阳性，但对全血样品和扁桃体检测均能特异性的检测，可作为初步筛选；CSFV抗原ELISA方法相对来说准确性高、重复性好，可首选，虽然CSFV糖蛋白ErnsELISA的敏感性最低，但可检测出猪群是否感染猪瘟病毒野毒，可作为控制与净化CSF时的备选方法。

CSFV糖蛋白ErnsELISA与CSFV抗原ELISA方两种方法的符合率较高，达75%。血清样品与全血样品存在差异。原因是糖蛋白ErnsELISA主要针对糖蛋白Erns，而CSFV抗原ELISA方法主要针对E2蛋白，E2蛋白是CSFV主要的保护性抗原，是产生中和抗体的主要成分，两者侧重点不同，敏感性存在差异属正常情况。另外，全血样本的敏感性高于扁桃体样本，这可能与病毒发展的时期不同，第2次检测时病毒已发展到病毒血症，所以血液的检出率高于扁桃体样品。

本试验在对2个场的公猪精液进行检测时，发现公猪精液均有CSFV，贵港场平均阳性率在33.33%以上，横县场在26.67%以上，但2个场公猪却不表现临床症状。众所周知，带毒公猪可通过精液将病毒传染给母猪。带毒母猪妊娠后病毒通过胎盘屏障感染胎儿造成垂直传播，产下带毒的仔猪或僵猪不断产毒、排毒，污染环境，感染其他健康猪，形成恶性循环。种公猪在该病的传播中也起着重要作用，病毒可通过带毒公猪精液垂直传播。因此，加强公猪，特别是种公猪的CSFV检测，从种源控制与净化猪瘟至关重要。

如果规模化养猪企业要自行进行大规模CSFV控制与净化工作，建议采用多种方法联合应用。即不同类别的动物采用不同的方法进行CSFV病原检测。主要分为几下几种情况：①种公猪：可采集精液，先用RT-PCR初步筛选，再用CSFV抗原ELISA，两种方法联合应用，均出现阳性者淘汰；②种母猪：采集全血和血清样品，先用RT-PCR初步筛选，再CSFV抗原ELISA复查，两种方法联合进行对应检测，均出现阳性者淘汰；③后备猪和小猪：RT-PCR初筛或CSFV抗原ELISA筛选。

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