大鼠肾缺血再灌注损伤程序性坏死的形态学观察

李郭锦，张路，穆长征，宋小峰，郭敏

大鼠肾缺血再灌注损伤程序性坏死的形态学观察

李郭锦，张路，穆长征，宋小峰，郭敏

目的观察大鼠肾缺血再灌注损伤程序性坏死的形态学变化。方法应用免疫印迹技术、免疫组织化学染色技术以及光学和电子显微镜技术对缺血60min再灌注24h的大鼠肾脏进行观察和分析。结果免疫印迹分析结果表明，与假手术组比较，大鼠肾缺血再灌注后受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)和肿瘤坏死因子受体α(TNFRα)表达增强。缺血再灌注损伤的肾组织内出现RIPK3免疫组化染色阳性细胞，主要分布于肾小管上皮。光镜下皮质和髓质外带的肾小管出现了程序性坏死，表现为细胞肿胀，着色苍白，细胞核固缩。电镜下程序性坏死表现为细胞质肿胀，细胞器肿胀、破碎，含有一个凋亡样细胞核。结论大鼠肾脏缺血60min再灌注24h后部分肾小管细胞发生了程序性坏死，肾组织中RIPK3表达增强。

肾；再灌注损伤；程序性坏死；大鼠

肾缺血再灌注损伤(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是诱发急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的主要原因，如肾移植、肾血管手术后都可发生RIRI，从而诱发AKI[1]。大鼠常用于建立RIRI引起的AKI动物模型，虽然有关大鼠RIRI引起肾脏细胞损伤的报道很多，但多集中在细胞坏死和细胞凋亡等[2-3]。近年来随着对细胞死亡机制研究的深入，出现了从生物化学或分子生物学变化角度分类和命名的新的细胞死亡方式。程序性坏死是本世纪初由哈佛大学科研人员发现的一种细胞死亡方式[4-5]，认为在程序性坏死过程中受体相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase，RIPK)的激活起着关键的介导作用。目前发现RIPK包括RIPK1和RIPK3两种，二者为同源体，它们的激活是细胞走向程序性坏死的关键[6]。但程序性坏死是否参与了肾缺血再灌注损伤，以及RIRI时RIPK3的表达如何目前鲜见报道。本研究建立了RIRI大鼠模型，应用免疫印迹分析、免疫组织化学染色以及光镜、电镜技术对肾组织的程序性坏死进行观察，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料 羊抗大鼠肿瘤坏死因子受体α(tumor necrosis factor receptor α，TNFRα)以及RIPK3单克隆抗体(Abcam公司)；二抗试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物及模型制备 健康SD大鼠10只，雌雄各半，体重200～250g，由辽宁医学院实验动物中心提供。按实验条件随机分为两组，每组5只。缺血再灌注损伤(RIRI)组：苯巴比妥钠麻醉后开腹，应用无损伤血管夹阻断双侧肾动脉血流60min后放开；假手术(Sham)组：手术过程同前，但不阻断肾动脉血流。两组动物关腹后于无菌条件下饲养24h后取材。

1.2.2 取材 动物麻醉后经腹主动脉取血2ml用于肾功能常规检查。切取新鲜右肾组织备用，用2.5%多聚甲醛戊二醛经腹主动脉逆行灌流左肾，灌流成功后于肾门处冠状面切开肾脏，一半用于常规石蜡切片，另一半用于电镜标本制备。

1.2.3 RIPK3和TNFRα免疫印迹检测分析 两组新鲜肾组织加入RIPA裂解液，0℃下剪碎，超声波粉碎20s后静置30min，4℃下12 000r/min离心20min，留取上清液，BCA法测定蛋白含量，并按每20μl含50μg蛋白制成样品，－20℃冰箱保存。取已制备样品适量加入电泳槽，100V电压下电泳，转膜，常温下半干转印，TBST冲洗后，5%小牛血清白蛋白室温封闭1～2h。分别加入一抗( RIPK3、TNFRα抗体，稀释度为1:1000)4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗脱3次，每次5min，分别加入二抗(辣根过氧化酶标记的IgG抗体，稀释度为1:200)室温孵育1h，TBST缓冲液洗脱3次，每次5min，ECL发光显色，采用β-actin作为内参。扫描电泳条带，凝胶分析软件分析各目的蛋白条带吸光度(A)值。用目的条带与内参条带A值的比值表示待测蛋白含量。

1.2.4 石蜡包埋切片的制备 用于石蜡切片的组织经水洗后进行系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋(使切片呈冠状面方向)，4～5μm厚切片，部分切片经HE染色，光镜观察，部分切片用于免疫组织化学染色。

1.2.5 RIPK3的免疫组织化学染色 采用石蜡切片免疫组化Envision法。切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢溶液处理30min去除内源性过氧化物酶，高压修复抗原，滴加1:100稀释的RIPK3单克隆抗体，4℃过夜，滴加辣根酶标记抗羊多聚体(PV9003)，37℃孵育30min，DAB显色。以上各步骤之间用0.01mol/L PBS洗涤3次，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光镜下观察。阴性对照用PBS替代一抗。蛋白阳性表达呈棕黄色。

1.2.6 电镜标本的制备 经2.5%多聚甲醛戊二醛固定的肾组织再经1%锇酸后固定，缓冲液水洗3次，每次15min，经梯度乙醇脱水、丙酮处理，采用树脂Epon812包埋。超薄切片机行半薄切片，厚1μm，甲苯胺蓝染色，光镜观察定位后再行超薄切片，厚70nm，重金属双染色，EX1200透射电镜观察。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，所有数据均以表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肾功能检查结果 RIRI组动物血尿素氮为39.1±2.7mmol/L，血清肌酐318±26mmol/L；Sham组动物血尿素氮为4.2±0.8mmol/L，血清肌酐88±17mmol/L，说明肾缺血60min再灌注24h动物肾功能处于衰竭状态。

2.2 免疫印迹检测分析结果 RIRI组大鼠肾组织RIPK3和TNFRα蛋白表达(分别为0.6792±0.0379、0.4062±0.0360)与Sham组(分别为0.0458±0.0132、0.0554±0.0102)比较均明显增强(P＜0.05，图1)。

图1 两组免疫印迹电泳条带Fig.1 Protein products by immunoblot analysis in two groups of rats

2.3 光镜观察结果

2.3.1 RIPK3免疫组织化学染色结果 Sham组肾组织呈阴性反应；RIRI组肾组织RIPK3阳性部位出现棕褐色沉淀，分布在近端小管和远端小管细胞近游离面及侧基底膜胞质内(图2)。

图2 两组RIPK3免疫组织化学染色结果(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of RIPK3 in two groups of rats (×400)

2.3.2 肾组织学观察结果 如图3所示，Sham组肾小管上皮细胞呈立方形，胞质嗜酸性，核大，染色浅；RIRI组肾小管上皮细胞出现肿胀苍白，细胞轮廓尚可辨认，部分细胞胞质呈大空泡状，固缩的核位于空泡内(箭头所示)，说明RIRI时肾小管上皮细胞发生了特殊的细胞死亡，即程序性坏死。

图3 两组肾组织学观察结果(HE ×400)Fig.3 Histopathologic change of renal tissue in two groups of rats (HE ×400)

2.4 电镜观察结果 Sham组肾小管上皮细胞结构正常，细胞呈立方形或锥体形，核染色质疏松，线粒体等细胞器结构正常；RIRI组肾小管上皮细胞出现程序性坏死，表现为细胞核染色质固缩，细胞质肿胀，细胞器如线粒体等也肿胀破碎，有时崩解并大量减少，易与周边坏死细胞区别(图4)。

图4 两组肾小管上皮细胞电镜图像(×5000)Fig.4 Electron micrographs of proximal tubule cells in two groups of rats (×5000)

3 讨 论

大鼠肾缺血60min再灌注24h是国内外学者常用的RIRI引致AKI动物模型[7-8]，本研究结果确认了这一动物模型的建立，肾缺血60min再灌注24h大鼠肾功能处于衰竭状态。

程序性坏死是2008年由哈佛大学科研人员发现的新的细胞死亡方式[4]，2012年被国际细胞死亡分类命名委员会正式接受[5]，其形态特点为坏死样细胞质含有一个凋亡样的细胞核(apoptosis-like nucleus)，前者表现为细胞质肿胀，细胞器如线粒体等也肿胀变性，严重时细胞器崩解消失，后者表现为核染色质固缩，有时边聚[9]。本研究在光镜和电镜下观察到上述程序性坏死出现在缺血再灌注损伤的肾小管上皮细胞，说明缺血60min再灌注24h可引起肾小管上皮细胞发生程序性坏死。

有研究认为TNFRα是启动程序性坏死的死亡受体之一，导致程序性坏死的细胞外信号是通过TNFRα接受并组合后导致RIPK激活的，由此细胞发生程序性坏死[4-6]。本研究的免疫印迹检测结果显示，TNFRα蛋白在缺血60min再灌注24h的肾组织表达增强，提示TNFRα可能是RIRI时引起程序性坏死的死亡受体。

有学者认为在程序性坏死过程中，RIPK的激活起着关键的介导作用[5-6]，即RIPK激活后细胞发生程序性坏死的可能性增加，因此可作为判定程序性坏死的参考生物指标，也有人认为RIPK激活引起的细胞死亡可称为RIPK介导的细胞死亡[5-7]。

2012年，美国学者Linkermann等[8]第一次揭示了RIRI可引起肾小管上皮细胞发生RIPK1介导的细胞死亡，同时应用免疫印迹分析发现RIRI时RIPK3和RIPK1的表达均增强，但他们没有对RIRI的肾脏进行RIPK3免疫组织化学染色和电镜下观察。本研究结果发现，RIRI时RIPK3在肾小管免疫组化染色的表现与Linkermann所见RIRI中RIPK1的表现是一致的。有学者认为单一RIPK1激活不能完成程序性坏死，只有RIPK1先行激活，等待RIPK3激活后二者才形成necrosome，即坏死诱导复合体(necrosisinducing complex)，才能使受损的细胞发生程序性坏死[7,10]。本研究对RIRI肾组织进行了RIPK3免疫组织化学染色观察，发现缺血60min再灌注24h的肾组织出现了RIPK3的阳性表达。

综上所述，大鼠肾脏缺血60min再灌注24h后肾组织RIPK3表达增强，形态学观察发现肾小管上皮细胞发生了程序性坏死，即观察到了特殊的细胞死亡：坏死样细胞质内含一个凋亡样的细胞核。

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Morphological observation of necroptosis after renal ischemia-reperfusion injury in rats

LI Guo-jin1, ZHANG Lu2, MU Chang-zheng3*, SONG Xiao-feng3, GUO Min3*
1Department of Medical Imageology, Third Affiliated Hospital, Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121001, China
2Department of Nursing, Panjin Vocational and Technical College, Panjin, Liaoning 124010, China
3Department of Histology and Embryology, Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121001, China
*

s. Mu Chang-zheng, E-mail: muchangzheng2008@sohu.com; GUO Min, E-mail: mguo1118@yahoo.com.cn
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31200871), Natural Science Foundation of Liaoning Province of China (201202141), and Science Foundation of Liaoning Medical University (20101311)

ObjectiveTo observe the morphological changes of necroptosis after renal ischemia-reperfusion injury (RIRI) in rats.MethodsImmunoblot analysis, immunohistochemical staining and light and electron microscope were used to observe and analyze necroptosis in the renal tissue after 60min ischemia and 24h reperfusion.ResultsImmunoblot analysis showed that the expression of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3) and tumor necrosis factor receptor α (TNFRα) in the kidney was significantly higher in RIRI group than in sham group. Immunohistochemical staining showed positive cells of RIPK3 in the kidney was evident in RIRI group, which distributed mainly in the renal tubular epithelium. Renal tubular cells undergoing necroptosis were evident in both cortical and outer region of the medulla after 60min ischemia and 24h reperfusion and morphologically featured by necrotic cytoplasm containing an apoptosis-like nucleus under electron microscope.ConclusionNecroptosis occurred in renal tubular cells and the expression of RIPK3 could increase in renal tubular cells in rat after 60min ischemia and 24h reperfusion.

kidney; reperfusion injury; necroptosis; rats

R320.2345

A

0577-7402(2013)10-0792-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.002

2013-06-06；

2013-08-17)

(责任编辑：张小利)

国家自然科学基金(31200871)；辽宁省自然科学基金(201202141)；辽宁医学院博士启动基金(20101311)

李郭锦，硕士研究生。主要从事肾脏生物学方面的研究

121001 辽宁锦州 辽宁医学院附属第三医院影像科(李郭锦)；124010 辽宁盘锦 盘锦市职业技术学院临床护理系(张路)；121001 辽宁锦州 辽宁医学院组织胚胎学教研室(穆长征、宋小峰、郭敏)

穆长征，E-mail：muchangzheng2008@sohu.com；郭敏，E-mail：mguo1118@yahoo.com.cn