中药复方对猪大肠杆菌的体外抑菌活性研究

王俊丽 ，张要齐 ★,，孙雪峰 ，张新蕾 ，史 柯

（1.河南惠通天下生物工程有限公司，河南新郑 451162；2.河南惠通天下动物药业有限公司，河南郑州 450008）

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的肠道传染病，主要表现为仔猪黄白痢和水肿病，随着集约化养猪方式的日益加大，该病呈上升趋势，已成为仔猪死亡的主要原因之一。目前临床上常用抗生素进行治疗，虽然具有一定的疗效，但往往存在易产生耐药性及畜产品药物残留等问题，不仅影响到治疗效果而且还危害人类健康[1,2]。中药以其本身来源的广泛性、成本低廉、毒副作用小、且不易产生耐药性等优点在兽医临床受到重视，近年来，对于单味中药对猪大肠杆菌抑菌活性的研究报道很多[3-5]，但往往存在有效成分单一、作用不明显等问题，本研究在前续试验的基础上筛选了7个中药组方，并通过试管二倍稀释法和管碟法对其体外抑菌活性进行研究，旨在筛选出抗大肠杆菌的最佳组方，为临床治疗仔猪大肠杆菌病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 中药复方1：黄连、黄柏、白术、党参、赤石脂；复方2：黄连、黄柏、鱼腥草、金银花、赤石脂；复方3：黄连、黄柏、白术、防风、赤石脂；复方4：黄柏、穿心莲、金银花、连翘、赤石脂；复方5：黄连、黄柏、黄芪、白头翁、赤石脂；复方 6：黄连、防风、白术、党参、赤石脂；复方7：黄连、黄柏、板蓝根、鱼腥草、赤石脂。

1.1.2 供试菌株猪大肠杆菌由河南科技学院微生物实验室提供，所有菌种置于4℃冰箱保存备用。

1.1.3 供试菌株培养基（1）普通肉汤培养基：牛肉浸膏 3g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、纯化水至1000ml，pH值 7.2～7.4；（2）普通营养琼脂培养基：蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，NaCl5g，琼脂 20g，纯化水至1000ml，pH值7.2～7.4。配制后高压灭菌后4℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 药液的煎制：每个组方按比例混合，称取适量装入三角烧瓶中，加10倍量水浸泡2h，电炉加热微沸2h，8层纱布过滤，药渣再加8倍量水煮沸1h，过滤后合并2次滤液，离心过滤、浓缩至终浓度为1g/ml。调pH7.3，分装，高压灭菌，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌液制备：菌种接种于普通琼脂培养基上，37℃培养24h，挑取典型菌落接种于新鲜肉汤培养基中，37℃培养18h，备用。

1.2.3 18种中药最小抑菌浓度（MIC）的测定[6]

采用试管二倍稀释法：（1）取灭菌有棉塞试管11支并编号，每管先加入无菌肉汤培养基2.0ml，于第一管中加入灭菌的受试复方中药水提物2.0ml，混匀后取出2.0ml放入第2管中，依次梯度稀释直到第9管取出2.0m l弃去，第10管不加药物，作为阳性对照，第11管加受试复方中药水提物2.0ml，混匀后取出2.0ml弃去，不加细菌，作为阴性对照。各管平行3份。（2）经肉汤培养基培养18h的试验菌液用无菌肉汤稀释100倍。取细菌稀释液0.1ml分别加入上述1～10管中混匀，11号管加0.1ml灭菌生理盐水，置各管于恒温培养箱中培养24h，观察结果。在阳性对照管细菌生长呈混浊状，而阴性对照管无细菌生长呈透明状的前提下，观察其他试管的混浊情况。如试管内混浊，说明有细菌生长；如试管内澄清透明，证明无细菌生长。无细菌生长而含药液浓度最低者，即为该种药物对该菌株的最低抑菌浓度。

1.2.4 18种中药最小杀菌浓度（MBC）的测定

取MIC终点浓度以上未生长细菌的各稀释管内培养物0.1ml，接种于琼脂平板培养基上，于恒温培养箱培养24h，观察有无细菌生长，培养基中无细菌生长的最低浓度即为受试中药水提物的最低杀菌浓度。

1.2.5 药物敏感试验

采用管碟法：将灭菌后的营养琼脂培养基倾入灭菌培养皿内，放置凝固用作底层培养基。用无菌吸管吸取大肠杆菌培养液（稀释为106cfu/ml）0.1m l，滴于底层培养基上，用无菌棒将菌液涂匀，待表面干燥后，用无菌镊子在每个平皿中等距离放置3个牛津杯，用滴管分别将药液加到牛津杯中，以滴满为度，盖上平皿盖。然后将滴加药液的平皿水平置恒温箱内，37℃培养18～24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。抑菌圈直径>20mm为高敏，抑菌圈直径15～20为中敏，抑菌圈直径<15mm为低敏，无抑菌圈为不敏感[4]。

2 结果与分析

2.1 试管二倍稀释法测定各复方中药的体外抑菌试验结果

结果见表1。

表1 各复方中药的体外最低抑菌浓度和最低杀菌浓度试验结果

由表1可知，复方1和复方3对猪大肠杆菌的抑菌效果较好，MIC值和MBC值均为15.63mg/ml和62.5mg/ml；其次是复方5和复方4，复方 5MIC值和 MBC值为 31.25mg/m l和62.5mg/ml，复方 4MIC值和 MBC值均为62.5mg/ml。而复方2、复方6和复方7抑菌效果不明显，MIC值和MBC值相对较高。

2.2 管碟法测定各复方中药的体外抑菌试验结果

结果见表2。

由表2可以看出，复方1和复方3的平均抑菌圈直径相对较大，分别为15.20mm和17.99mm，抑菌强度均为中敏；其他几个复方抑菌强度相对较低，均为低敏。

表2 各复方中药的药敏试验结果

3 讨论

中药复方研究是中医药现代化研究的重点与难点之一，也是中医辨证论治理论精髓的具体体现，它是在辨证审因决定治法以后，选择合适的药物酌定用量，按照组成原则妥善配伍而成的一组药物，其所含化学成分复杂，药理作用具有多靶点、多层次的特点[7]。本研究在前续单味中药体外抑菌试验的基础上，结合中药复方之特点以及仔猪腹泻的中兽医理论完成组方，整个处方筛选过程严格遵循科学性原则。按中兽医辨证理论，大肠杆菌病为湿热壅积肠道而引起的里热证，宜清热解毒、燥湿止痢[8]。早先就有报道显示，清热药绝大部分具有抑菌作用[9]。部分研究者以清热解毒、清热燥湿为药物筛选方向，寻找专门针对致病性大肠杆菌的单味中药与组方[10]。本研究从抗菌消炎、清热燥湿、泻火解毒、健脾理气、胜湿止痛、涩肠止泻等方面入手，结合兽医临床实践，按照中兽医理、法、方、药的基础理论进行组方，并通过其对猪大肠杆菌的体外抑菌活性筛选最佳组方。

本研究结果显示，复方1和复方3在试管二倍稀释法和管碟法中均表现较好的抑菌效果，两个组方MIC值和MBC值相同，从二者抑菌强度来看，复方3比复方1平均抑菌圈直径较大，但二者均在中敏抑菌强度范围之内。从二者复方组份分析，两个复方均含有黄连、黄柏、白术和赤石脂，整个复方仅为防风和党参之间的差异，从二药药理功效来看党参补中益气、健脾生津，与白术是常配药[11]；防风胜湿止痛，止痉定搐，古方中常用防风作为痛泻药方的引经之要药，其能舒脾泻肝加之白术的燥湿健脾，二者相配可以补脾土而泻肝木，调气机以止痛泻。鉴于中药古方之精髓以及良好的体外抑菌效果，本研究确定复方3为最佳组方。

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[5]邬苏晓,肖正中,李淑仪.20种中草药水提物的体外抑菌试验[J].安徽农业科学,2008,36(19):8104-8105.

[6]张兴,邓淑华,佟继铭.满药赤雹果挥发油体外抑菌活性研究[J].时珍国医国药2011,22(5):1089-1090.

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