响应法优化提取酸浆籽中蛋白质的研究

于开源，鞠晓峰，郑丽娜

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

酸浆Physalis alkekengil，茄科植物，又名锦灯笼、挂金灯、红菇。我国主要产地为内蒙古呼伦贝尔盟和黑龙江大兴安岭地区[1-2]。果实不仅有很好的药用价值，而且还有很高的食用价值，酸浆味酸、苦，性寒。具有清热解毒、利咽化痰、利尿等作用[3]。酸浆籽中的蛋白质含有多种氨基酸，人体必需的氨基酸俱全，它不仅拥有许多药用价值，而且还是一种很好的保健品，酸浆籽中的蛋白质是优质的蛋白质资源，具有很大的发展前景，有待于进一步开发和利用。酸浆蛋白的研究很少，浆果含酸浆醇A、B；种子中含禾本甾醇、钝叶醇、环木菠萝烷醇、环木菠萝烯等[4-5]。目前对于植物种籽中蛋白质的提取方法很多，有热水提取法、超声提取法、酶法等[6-9]。但这些工艺都不是很成熟，最成熟的方法是采用碱提酸沉法。加酸至等电沉淀蛋白法是从提取液中分离蛋白的最简单的方法，它能确保提取液中的蛋白最大程度的沉淀，采用此方法可以将材料中含量很少的蛋白提出来，酸浆中的蛋白质的含量极少，对于其它的提取方法均不能有效的将其提取并测试出来，故在论文中选择了碱提酸沉法作为酸浆籽蛋白的提取工艺[10]。论文主要是研究经过超临界萃取后的酸浆籽粕为原料，通过响应面优化确定提取蛋白质的最佳工艺参数，由于响应法优化准确率很高，误差小，现被广泛采用[11-12]，因此在实验设计上主要采用响应面优化实验设计，可以为酸浆籽中蛋白质的开发和利用提供理论依据和帮助，为进一步开发其相关产品奠定理论基础。

1 实验设计与方法

1.1 实验材料

酸浆果实，购于黑龙江省建三江农管局（七星农场）；超临界CO2萃取后的脱脂酸浆籽粕（黑龙江八一农大学食品学院自制）。

1.2 实验方法

1.2.1 碱提酸沉法籽粕工艺流程

酸浆脱脂籽粕——碱液浸提——离心（4 000 r·min-1、20 min）——过滤——清液——加HCL 调pH 至等电点——离心分离——沉淀——冷冻干燥——酸浆籽蛋白质

1.2.2 pH 对酸浆籽粕蛋白提取的影响

准确称取2.000 g 粉碎后酸浆籽粕5 份，用NaOH 调整磷酸二氢钾—磷酸氢二钠浸提液的pH分别至7、8、9、10、11，然后按料液比1∶25，分别加入pH 为7、8、9、10、11 的磷酸二氢钾—磷酸氢二钠浸提液，在40 ℃下搅拌浸提1 h，将上清倒入离心管中离心20 min（4 000 r·min-1），用凯氏定氮法测定其中的蛋白质提取率及确定最佳pH。

1.2.3 温度对酸浆籽粕蛋白质提取率的影响

准确称取2.000 g 粉碎后酸浆籽粕，按1∶25 的料液比加入前述试验中确定的最佳pH 值浸提液，至于30，35，40，45，50 ℃下搅拌浸提1 h，同上，测定蛋白质的提取率及确定最佳温度。

1.2.4 料液比对酸浆籽粕蛋白质提取率的影响

准确称取2.000 g 粉碎后酸浆籽粕，按1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 的料液比，加入最佳pH 的浸提液，在最佳温度条件下搅拌浸提1 h，同上，测定蛋白质的提取率及确定最佳料液比。

1.2.5 提取时间对酸浆籽粕蛋白质提取率的影响

准确称取2.000 g 粉碎后酸浆籽粕，选取最佳料液比及最佳pH 浸提液，在最佳温度下分别浸提20、30、40、50、60 min，同上测定蛋白质的提取率及确定最佳提取时间。

1.2.6 酸沉等电点的确定

酸沉等电点的确定取50 mL 蛋白质提取上清液7 份，分别用1 mol·L-1HCl 调节pH 值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，静置2～3 h，离心分离后，将上清液稀释40 倍后进行比色测定。

1.3 分析方法

蛋白质的测定：采用凯氏定氮法（氮对蛋白质转换系数取5.95）。按下式计算蛋白质提取率和制品的纯度。蛋白质等电点的测定：采用比色法测定。

蛋白质的提取率=提取液中蛋白质含量/ 酸浆籽粕中蛋白质含量×100%

2 实验结果与分析

2.1 不同单因素对酸浆籽粕蛋白质提取率的影响

2.1.1 浸提液pH 对酸浆籽粕蛋白质提取率的影响

不同pH 溶液处理对酸浆籽中蛋白质提取率的影响结果见图1。

图1 浸提液pH 对酸浆籽粕蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of extract pH of Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

在pH7～9 的范围内，随着pH 的升高，蛋白质的提取率升高，当pH 为9 时，蛋白质的提取率达到最大；随后随着pH 的升高，提取率反而下降，且样品液体中有异味。当pH 较高时，蛋白质过度水解，提取率降低，同时氨基酸之间有可能发生缩合反应，生成了异味物质。有研究表明，碱性太强可引起脱氨、脱羧、肽键断裂，引起胱赖反应，将氨基酸转变为有毒化合物。因此，提取酸浆籽粕蛋白质的适宜pH 为9。

2.1.2 温度对酸浆蛋白质提取率的影响

以pH=9 和固液比1∶25 测定不同温度对蛋白质的提取率的影响，结果见图2。

从图2 知，在温度50 ℃时酸浆籽粕中蛋白的提取率最大；30～50 ℃时，提取率随温度的升高而增加；这是由于随着温度的升高，蛋白质分子的构象会发生微变，有利于蛋白质分子和水分子的运动及其相互作用，温度的升高对蛋白质溶解起到了增溶作用，当温度由此点升高时，蛋白质随温度的升高而降低，这是由于温度过高可造成部分蛋白质变性。因此，提取酸浆籽粕蛋白质的适宜温度为50 ℃。

图2 温度对酸浆籽粕蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of the temperature on protein extraction rate of Physalis alkekengi seed meal protein

2.1.3 料液比对蛋白质提取率的影响

不同料液比对酸浆蛋白质提取率的影响，见如图3。

图3 料液比对蛋白质提取率的影响Fig.3 Material liquid ratio on protein extraction rate influence

从图3 可知，蛋白质的提取率随料液比的增加而增大。当料液比为1∶10 时，蛋白质的提取率26.52%，远低于其它实验组，这是由于酸浆籽粕中含有一定量的膳食纤维，具有较强的吸水膨胀能力，使物料因流动性差而难于搅拌，导致蛋白质提取率低。当料液比为1∶25 时，提取率为最大，随着料液比的增大，提取率下降，由于料液比对其它影响考虑不是很明显，故在响应值设计时，不做考虑，提取酸浆籽粕蛋白质的最佳料液比为1∶25。

2.1.4 提取时间对蛋白质提取率的影响

选取在温度40 ℃，料液比1∶25，pH=9，提取时间对蛋白质提取率的影响见图4。

图4 提取时间对酸浆蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of Physalis alkekengi protein

从图4 可知，在一定条件下，在提取时间为20～40 min 的范围内，随着提取时间的延长，酸浆籽粕中蛋白质的提取率升高，当提取时间为40 min 时，蛋白质的溶出率最高，蛋白质的提取率达到最大；随后随着提取时间的延长，提取率反而下降。因此，提取酸浆籽粕蛋白质的最佳提取时间为40 min。

2.2 响应面法优化酸浆籽粕蛋白质提取条件

根据Box-Behnken 的中心组合设计原理，以提取液pH、提取温度、提取时间三个因素为自变量（分另为X1，X2，X3表示），以酸浆籽粕中蛋白质提取率为响应值设计三因素三水平共15 个实验点的响应面分析实验，15 个实验点分为12 个析因点和3 个零点，每个试验因素水平选取如表1：

表1 酸浆籽粕蛋白质提取工艺三因素三水平响应面分析试验设计表Table 1 Physalis seed meal protein extract process three factors and three levels of response surface analysis test design

实验以随机次序进行，将实验所得的多糖提取率用Minitab15.0 程序进行分析，得出响应面分析图、回归拟合方程以及方差分析表。响应面实验设计与结果见表2。

表2 碱溶酸提法提取条件优化实验设计及结果Table 2 Alkali and acid extraction condition optimizing the experimental design and results

表3 三因素三水平中心组合参数估计Table 3 Three factors and three levels center combination parameter estimation

利用Minitab 软件对实验数据进行分析，由表3得出拟合二次多项式方程为：

Y=55.460 0-1.571 3 X1-0.362 5 X2-1.166 3 X3-16.000 0 X12-3.652 5 X22-3.145 0 X32+1.667 5 X1X2-2.970 0 X1X3+0.307 5 X2X3

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表3 知，对方程影响显著程度由大到小依次为提取液pH、提取温度、提取时间，其中提取液pH处理比提取温度、提取时间对方程影响最为显著，这说明提取液pH 对实验起关键作用，用碱液处理后，时间过长物料可能变性，影响其提取率，并且得知方程一次项和二次项是极显著的，所以各因素之间并不是简单的线性关系，而是二次关系。由表4 知模型的回归显著，交互作用较好；失拟项F 值很小为0.32，表明该方程对实验拟合情况好，实验误差小。因此可以用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。

同时做出中心组合设计试验所得的三组响应面曲面图（图5～图7）。响应面图形是特定的响应值Y（酸浆蛋白质提取率）对应的因素X1、X2、X3构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。图中可看到拟合曲面有最大值，对拟合方程求偏导，可得出模型最大值，即为最优的试验方案。

图5 pH 值和温度对酸浆籽粕蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of pH and temperature on Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

图6 pH 值和提取时间对酸浆籽粕蛋白提取率的影响Fig.6 Effect of pH and extract time on Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

图7 提取温度和提取时间对酸浆籽粕蛋白质提取率的影响Fig.7 Effect of temperature and time on Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

为了进一步确证最佳点的值，利用上述分析进行最优工艺的推导，对回归方程取一阶偏导数为零并整理得：

联立上述（2）、（3）、（4）三个方程求解，得到X1=0.030 5，X2=0.033 5，X3=0.218 3。换算后得到最佳工艺条件是pH 为9.1、提取温度为50.1 ℃、提取时间为42.2 min。由回归方程预测酸浆蛋白质提取的理论提取率为51.9%。

设计上为了检验响应面法所得结果，采用上述优化条件重复实验3 次，将提取率工艺参数修正为：pH 为9.0，提取温度为50 ℃，提取时间为42 min。在此条件下实际多糖提取率为49.1%，与理论预测值相比，其相对误差约为0.41%，说明了回归方程的预测值与实验值之间具有较好的拟合度。

3 结论

3.1 对碱提工艺中影响蛋白质提取率的提取液pH值、提取温度、料液比、提取时间4 个单因素进行实验，结果表明：提取液pH 值、提取时间提取温度对酸浆籽粕蛋白质的提取率影响显著，而料液比的影响不显著。

3.2 采用响应化优化碱提工艺参数，以最终提取纯蛋白质为指标，确定碱提最佳工艺参数为：提取液pH=9.0，提取温度50 ℃，料液比1∶25，浸提42 min。按此工艺条件提取酸浆籽粕蛋白质，提取率为49.1%。

3.3 通过验证性实验证明了响应面优化的实验条件的可靠性，实验结果与预测值具有较好的拟合，证明采用响应法优化对微波法辅助提取酸浆籽中蛋白质的提取率实验设计可靠，具有可行性。

［1］刘雅杰，于得江，李宝荣.酸浆资源和利用［J］.中国野生植物，1990（2）：35-36.

［2］李静，李娟，李德坤.锦灯笼化学成分的研究［J］.中草药，2002，3（8）：692-693.

［3］国家药典委员会编.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2000.

［4］单立冬，郭试瑜，俞光，等.灯笼草镇痛作用及其机理的研究［J］.中药药理与临床，2001，17（1）：12-15.

［5］张乃辉.鲜品酸浆草的外用［J］.中国民间疗法，2003，11（4）：28.

［6］张恒，何泽伟，余辉.从野生荞子提取蛋白质和淀粉的研究［J］.郑州粮食学院学报，2000，21（1）：36-38.

［7］绍佩兰，徐明.提取大豆分离蛋白的工艺研究［J］.粮油加工与食品机械，2005（9）：47-51.

［8］孟岳成，张学，兵邱蓉.响应曲面法优化大豆多糖微波提取工艺［J］.食品研究与开发，2009，30（2）：8-31.

［9］周睿，曹龙奎，鹿保鑫.响应面法优化去除黄米淀粉中蛋白的研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（2）：53-57.

［10］王亚林，陶兴无，钟方旭.碱酶两步法提取米渣中蛋白质的工艺研究［J］.中国油脂，2002，27（3）：53-54.

［11］洪楠，侯军，李志辉.MINITAB 统计分析教程［M］.北京：电子工业出版社，2007.

［12］李钊，王娜妮，陈栓虎.响应面优化法研究花椒籽油在近临界水中的水解［J］.中国油脂，2009，34（5）：28-31.