产人参皂苷类似物工程菌提取物TLC展开系统的研究

2013-08-06王忠乔杨轩岳才军

黑龙江八一农垦大学学报 2013年2期

王忠乔，杨轩，岳才军

（黑龙江八一农垦大学生命技术学院，大庆 163319）

薄层层析（TLC）是50年代以后发展起来的一种分离、分析方法，是一种与柱层析原理相近的分析方法。兼具鉴定分离双重特性、结果直观、操作快捷、设备简单、花费小等一系列优点，使其成为药学尤其是中药学研究中最常用的分析手段[1-3]。同时薄层层析的结果对高效液相色谱（HPLC）等分析方法具有重要的借鉴意义。使其在化工、医药、农业、食品等方面快速的发展。

人参皂苷作为人参中最重要的活性成分一直备受关注，人参皂苷具有抗疲劳，调节神经，抗癌等多种重要的作用[4]。传统栽培已完全无法满足市场和研究的需求，如何大量生产人参皂苷和转化稀有皂苷成为现阶段研究的重点，同时快速检测和分离人参皂苷、皂苷类似化合物及皂苷前体物质的技术也成为热点之一。酵母菌株（Y828-15-1），是实验室保藏的一株通过分子手段构建、筛选的能产生皂苷类似物的优良菌株。通过人参基因组转染酿酒酵母，使酿酒酵母表达人参皂苷合成所需的前体物质及酶类，改变酿酒酵母代谢途径，使其能够产生皂苷类似化合物。

自80年代人参研究进入精密实验阶段以来，薄层层析一直是鉴定和分离人参皂苷的重要方法。已有报道的人参抽提物展开系统有几十种，都能对人参皂苷进行不同程度的分离。但对分离酵母生产皂苷类化合物的展开系统还没有被报道过。实验选取了较常用的5 种人参抽提物层析展开系统与实验室优化的对Y828-15-1 抽提物展开系统进行对比，以期找到适合的TLC 方法，加快对酵母生产的皂苷类似产物的鉴定和分离速度。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

人参皂苷标准品（购于吉林中医药大学），薄层层析板（青岛海洋，G 硅胶，10 cm ×20 cm），展开剂所需有机溶剂（分析纯），微量注射器，层析缸，超声破碎仪，恒温水浴锅，恒温摇床。

1.2 样品的制备

取预存在50%甘油中的酵母菌涂布在YPD 平板上活化24 h。挑取单菌落接入装有5 mL YPD 培养基的试管中，置于恒温摇床中30 ℃160 r 培养8 h。离心收集菌体，并用无菌水清洗两次。将收集的菌体置于2 mL EP 管中。在EP 管中缓缓加入1 mL 甲醇，超声破碎5 min。60 ℃水浴加热24 h，水浴过程中多次震荡，使提取完全。离心取上清，移入新的EP 管中。

1.3 标准品的制备

精确称取人参皂标准品粉末10 mg，甲醇定容至10 mL。即为浓度为1 mg·mL-1的人参皂苷标准样品。

1.4 薄层层析

1.4.1 点样

在活化后的成品G 硅胶薄层层析板边缘1.5 cm处划一条横线，作为起点线。在起点线上等距离取数个点样点。点样点间距及到层析板边缘距离应不小于1 cm。用微量注射器将制备好的样品及人参皂苷标准品点在点样点上。点样斑点不宜过大，应保持在直径2 mm 之内，同时点样量不宜过多，以免造成拖尾。

1.4.2 展开剂

选择了2005 版国家药典及以报道过的常用人参皂苷展开系统5 种，实验室参考PRISMA 模型优化理论优化展开系统1 种，如表1：

S1：最广泛使用的人参皂苷鉴定用TLC 展开系统

S2、S3：2001年周漩等优化的分离人参皂甙用TLC 展开系统[5]

S4：实验室优化的Y828-15-1 菌株抽提物用TLC展开系统

S5：《中华人民共和国药典》（一部）2005 版推荐的人参鉴定用TLC 展开系统[6]

S6：一种分离人参皂苷Rb1 和Rg1 用TLC 展开系统[7]

表1 展开剂配比方法和结果Table 1 The ingredients of developer and the results of experiment

1.4.3 展开

将展开剂按所需比例混合，10 ℃静置4 h。吸取展开剂和点好样品的层析板放置到层析缸中饱和1 h后进行展开。展开剂的高度以没过层析板8～10 cm为适宜。封闭层析缸后展开剂上行12～15 cm 后取出硅胶板，室温自然挥干。

1.4.4 显色

饱和碘蒸汽显色至斑点清晰可见，显色时间不宜过长。

2 结果和分析

2.1 结果

展开系统S1 结果如图1 所示，在Rf=0.8～0.85间可以看到3 个清晰的斑点标记为a，b，c，Rf=0～0.6间有一系列不明显的斑点。2 号展开系统结果如图2所示，在Rf=0.35～0.45 间有2 个清晰的斑点d，e。3号展开系统如图3 所示，在Rf=0.3～0.5 间有两个清晰的斑点g，h。菌株Y828-15-1 在Rf=0.7 处显示了一个与其他组完全不同的清晰斑点，标记为f。4 号展开系统如图4 所示，在Rf=0.6 处有一个清晰的斑点i，菌株Y828-15-1 在Rf=0.4 和Rf=0.5 处有两个斑点标记为g，h。5 号展开系统和6 号展开系统无法良好的展开样品，在层析板上无法获得清晰的斑点（结果未列出）。

图1 S1 展开系统结果Fig.1 Result of S1 TLC solvent system

图2 S2 展开系统结果Fig.2 Result of S2 TLC solvent system

图3 S3 展开系统结果Fig.3 Result of S3 TLC solvent system

图4 S4 展开系统结果Fig.4 Result of S4 TLC solvent system

2.2 分析

S1 结果中有一系列不明显的斑点，预示着可能存在着多种未被完全分离的物质。S3 系统比S1、S2和S4 多加了正丁醇，结果显示正丁醇对皂苷标准品的Rf 改变没有明显的作用，对酵母提取物的分离起到一定的作用。但加入正丁醇后，展开剂粘度增加，展开速度明显降低，不利于快速鉴定和大量分离。S5系统中加入对人参皂苷Rg1 和Rg2 分离起关键作用的乙酸乙酯，两种酵母提取物和人参皂苷Rb1 标准品均无法分离，人参皂苷标准品Rh2 在Rf=0.9 处有斑点。S6 系统对所有样品和标准品均无法分离。

S1～S5 结果表明，甲醇和水的饱和程度对酵母抽提物薄层分离起着关键性的作用，但这种作用是极端敏感的，少量的改变易造成巨大的差异。酵母真核表达过程可能对产物进行一些极性化修饰，造成新产物极性过大，对检测造成不良影响。对甲醇和水的饱和程度的调节可以对展开剂极性进行调节，快速检测这种极性的改变。试验表明，甲醇与水的饱和度应取∶氯仿∶甲醇∶水=130∶70∶X（12