鱼组织线粒体基因组提取方法的改进

赵春霞，盛勃，唐德江，李鹏，赵和生，杨焕民，刘胜军

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

线粒体是真核细胞中普遍存在的一种重要而独特的细胞器，线粒体DNA 已被广泛应用于生物的发病机理、遗传变异、生物进化等多方面的研究，并取得了许多有价值的结果。动物线粒体DNA 具有分子量小、结构简单、只有16 Kb 左右[1-3]、母性遗传和进化速度快，个体内有高度的均一性，无组织特异性[4]，便于取材分析。同时，mtDNA 又具有广泛的种内和种间多态性，在亲缘关系相近的物种间其进化速度比核基因快。开展动物线粒体DNA 结构与功能的研究，对于深入了解生物体发育过程中基因表达与调控的分子机理，核质相互作用方式以及分析生物种间，种内的进化关系等都具有重要意义[5-7]。如何快速有效地提取mtDNA 无疑成了进行这些方面研究的前提。应用了碱变性法，对如何快速高效地提取mtDNA 进行了探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

以新鲜鲤鱼的肝脏、脾脏和肾脏组织为材料，材料购自大庆市水产品市场。

1.2 方法

取5～16 g 鲤鱼肝脏组织于少量SE 液中剪碎（或研磨碎），加约30 mL SE，以手动匀浆器上下匀浆10 次。将匀浆物1 100 r·min-1离心10 min 取上清液，以1 200 r·min-1离心12 min，沉淀即为线粒体，加5 mLSE 液悬浮线粒体，然后转至1.5 mL Eppendorf 管，每管1 mL 。每管加入1 mg·mL-1DNase1 1.5 uL 及RNaseA 2 uL，混匀，室温下静置70 min 后，在每管中加入70 uL 0.50 moL·L-1EDTA（pH8.0），1 200 r·min-1离心5 min，取沉淀，加入750 uL STE 洗涤沉淀。离心去上清，沉淀每管中加入220 uL 蛋白酶K，温浴2.5 h。1 500 r·min-1离心10 min，弃上清液，每管加150 mL TEN 溶液，混匀冰浴10 min，1 500 r·min-1离心10 min 取上清液，加入半倍体积的Tris-酚，室温振荡15 min 后以1 500 r·min-1离心10 min，小心吸取上层水相，去除残留的蛋白，重复此步骤2～3 次，直至中间白色的蛋白层基本没有，加入与原上清液1/2 体积的氯仿—异戊醇（23∶1），充分混匀。1 200 r·min-1离心10 min 取水相，加等体积异丙醇或无水乙醇混匀1 200 r·min-1离心12 min 取沉淀，用70%冷乙醇洗涤，1 200 r·min-1离心5 min 真空或自然干燥。加适量体积TE 溶解。

2 结果与分析

将提取的线粒体DNA 在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，以检测其纯度和相对分子质晕。琼脂糖凝胶浓度为0.1 ug·mL-1缓冲体系为TE 电泳液，在室温以5 V·cm-1恒压电泳当溴酚蓝行至离前端1.5 cm 时停止电泳后用清水冲洗，用凝胶图像分析系统观察，电泳条带为清晰、整齐、均匀的一条带，背景清晰。其中样本1 的拖尾较小，条带最为清晰，见图1。

图1 分离所得线粒体DNA 的电泳图谱Fig.1 The gel electrophoresis map of mitochondrial DNA

3 讨论

用本法提取出的鱼组织线粒体基因组结构完整，减少了分析的误差。本方法是在前人工作的基础上作了大量的试验而总结出来的，主要注意的几个问题如下：

3.1 匀浆器的匀浆次数是关键之一，匀浆次数过少时线粒体游离的量少，影响提取量；而匀浆次数过多时核膜破裂，增加了核DNA 污染。为了弄清楚上下匀浆的次数，可先匀浆5～6 次，取样；再匀浆5～6 次，取样；依次增加匀浆次数再分别取样。采用疏松的手动匀浆器匀浆，上下10 次即可，以免破坏细胞核，避免核DNA 的干扰。

3.2 差速离心是提取线粒体的关键。在提取鱼线粒体时，去除细胞碎片及杂质的离心力为1 000～1 500 r·min-1离心时间10～15 min；沉淀线粒体的离心力为1 200～1 500 r·min-1。离心力在1 200～3 500 r·min-1时随离心速度增加，沉淀内线粒体比例不断上升。

3.3 使用的Tris 酚的pH 值应在8.0，DNA 在pH 为7.8～8.0 的条件下比较稳定，在中性或酸性条件下，RNA 比DNA 更容易游离到水相，可获得RNA 含量较少的DNA 样品。

3.4 溶液的配制上适当提高了裂解液的浓度及pH值，加强脂类的洗涤效果，增强线粒体膜的裂解，对获得纯度较高的mtDNA 具有很好的效果。同时适当降低Tris-HCl 的浓度。增强低渗效果，增强细胞膜的通透性。

3.5 在提取线粒体DNA 的离心温度上，保证在4 ℃进行防止DNA 由于离心的温度升高而发生变性或断裂，影响其完整性。提高了后续研究酶切结果的准确性及真实性。

［1］王文，施立明.一种改进的动物线粒体DNA 提取方法［J］.动物学研究，1993，14（2）：197-198.

［2］戴建华，殷文莉，杨代淑，等.鲇鱼线粒体DNA 的酶切图谱［J］.水产学报，1994，18（4）：312-319.

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［5］李殿香.线粒体DNA 研究概况［J］.济宁师专学报，1999，20（6）：48-49.

［6］廖顺尧，鲁成.动物线粒体基因组研究进展［J］.生物化学与生物物理进展，2000，27（5）：508- 512.

［7］邵爱华，郑峰，吴胜，等.暗纹东方鲀mtDNA 的分离纯化及其细胞色素b 基因分子克隆［J］.水产科学，2005，24（5）：5-7.