非生物螯合剂EDTA与生物螯合剂EDDS联合施用提高植物提取土壤重金属效应的研究

白薇扬，赵清华，谭怀琴

(1.重庆理工大学 化学化工学院，重庆 400054;2.西南大学资源与环境学院，重庆 400715)

植物修复是利用可超富集重金属的植物吸收、积累环境中的污染物，并降低其毒害的环保生物技术［1－2］。早期植物提取技术研究主要集中在超富集植物方面，但超富集植物通常只能富集某种特定重金属，且生长速度慢，生物量低，这些不足限制了它在植物修复技术中的实际应用［3］。高生物量作物对重金属累积含量一般不高，但由于其生物量大，具有较高的重金属累积量，因而利用高生物量作物修复土壤已引起广泛的关注。

EDTA是螯合诱导植物修复土壤中最常用，也是研究最多的一种螯合剂，能大幅度增加植物对重金属的吸收和富集，提高植物修复效率［4－5］。但EDTA在环境中很难降解，残留时间较长，容易导致处理场所的重金属向周围和地下水迁移，造成二次污染。生物螯合剂EDDS与过渡金属具有螯合作用，能被生物降解，其生物毒性(包括对植物和土壤微生物的毒性)均低于EDTA，但是其对重金属Pb和Cd的螯合能力不如EDTA［6］。

一般而言，对于螯合诱导植物修复的研究基本集中在某一种螯合剂对重金属土壤污染的治理上，而对于可生物降解螯合剂EDDS和非可生物降解螯合剂EDTA的联合使用尚未见报道。本文在高生物量作物玉米和油菜上施用不同配比EDTA与EDDS，在获得最小环境风险的同时最大程度地提高螯合诱导效率，获得螯合诱导EDTAEDDS技术最佳施用配比量准则，以期对实际工程应用提供理论和技术支持。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试植物为单子叶植物玉米(zea mays L)、双子叶植物油菜(brassica junica)。实验土壤为重庆理工大学旁菜地表层0～30 cm的土壤，经自然风干后研磨，过4 mm筛备用。

1.2 实验方法

1.2.1 土壤培养

实验采用Cu、Pb、Cd三种重金属污染的土壤。每盆装3 kg土壤，分别设置添加CuSO4.5(H2O)700 mg· kg－1、CdCl2· H2O 25 mg· kg－1、Pb(N03)22600 mg·kg－1，共计20盆。重金属污染土壤反复混匀后静置平衡15 d后播种。

1.2.2 盆栽培养

盆栽试验在室内进行。每盆装3 kg经重金属平衡后的土壤，播撒20颗种子于盆中。待种子出苗3周后，每盆保留长势良好、生长高度约10 cm的幼苗5株。植物生长期间定期称重，定量补充水分100～200 mL，保证植物生长。同时室温控制在20～25℃，湿度控制在50% ～70%。出苗6周后，按如下处理方式分别添加EDTA和EDDS:①对照组(CK):加去离子水;② EDTA:施入3 mmol·kg－1EDTA;③ 配比 1(EDTA/EDDS=1∶1):施入 0.5 mmol·kg－1(EDTA)+0.5 mmol·kg－1(EDDS);④ 配比 2(EDTA/EDDS=2∶1):施入1 mmol· kg－1(EDTA)+0.5mmol· kg－1(EDDS);⑤ 配比3(EDTA/EDDS=1∶2):施入0.5 mmol· kg－1(EDTA)+ 1 mmol· kg－1(EDDS);⑥ EDDS:施入 3 mmol·kg－1(EDDS)。

盆栽植物在添加EDTA和EDDS 2周后进行收割处理。

1.3 测定方法

1.3.1 土壤理化性质测定

测得的土壤理化性质见表1。

1.3.2 植物及土壤样品中重金属含量测定

采集完整植株样品以及根际土壤。土壤为表层以下20 cm的土壤。

植株经自来水和超纯水清洗，80℃烘箱烘干，研碎过100目筛，待测。土壤样品采用四分法取盆中样品，自然风干后研磨过200目筛，待测。

植物样品的消解采用 Durali Mendil等方法［5］，即在 Teflon消化罐中加入 0.5 g植物样品，依次加入6 mL硝酸(65%)和2 mL双氧水(30%)，在微波炉中加压加热消解。消解完全后定容至25 mL。

表1 土壤的理化性质

土壤样品的消解采用Maiz等提出的连续提取方法［6］。将重金属 Pb、Cd、Zn的化学形态区分为活动态、可交换态和强结合态(残留态)。具体操作步骤如下:

1)活动态:称取3.0 g土壤样品置于50 mL离心管中，加入 30 mL 0.01 mol·L－1的 CaCl2溶液，室温震荡2 h，在离心机上离心10 min(3 000 r·min－1)，过滤上清液。残渣中加入5 mL去离子水，离心，弃去上清液，重复2次。

2)可交换态(络合态、吸附态、碳酸盐态和部分有机态):上步残留土样加入CaCl2和TEA(三乙醇胺)的混合溶液和6 mL DTPA，室温震荡4 h。所需混合溶液配制方案(按10 L计算):29.84 g TEA+3.93 g DTPA+2.94 g CaCl2·2H2O，溶于200 mL去离子水中，稀释至9 L，然后用1∶1的HCl调节 pH 值至 7.3 ±0.05，最后定容至 10 L。混合溶液的最终摩尔体积分数为0.005 mol·L－1DTPA、0.1 mol·L－1TEA、0.01 mol·L－1CaCl2。在离心机上离心10 min(3 000 r/min)，过滤上清液。残渣中加入5 mL去离子水，离心，弃去上清液，重复2次。

3)强结合态(残渣态):上步残留土样转入Teflon消解罐中，加入2 mL浓 HNO3(65%)和2 mL HF(40%)，200℃恒温加热消解8 h。

使用原子吸收分光光度计(岛津AA6800)测定其土壤和植物样品消解液中重金属Cu、Pb、Cd、Cr含量。

整个测定过程中土壤样用NIST 2710#标准物质，植物样用灌木枝叶GBW07602作质量控制参考物质。

测试过程中每批样品分析均作2个全程序空白，借以检查和控制样品在处理和测试过程中可能带来的污染。采用平行样控制样品测试的精密度，平行样品数不少于测试样品的10%。同时对每批样品进行加标回收，回收率为86% ～105%。

1.3.3 数据处理

采用 Origin8.0绘图，用 SPSS13.0进行显著性检验及相关分析。

2 结果与讨论

2.1 EDTA/EDDS配比对土壤有效态重金属含量影响

土壤有效态重金属是植物能吸收利用的土壤中活动态和可交换态重金属［7］。相比对照组，玉米组添加螯合剂的土壤有效态重金属含量显著增高(表2)。土壤有效态重金属Pb含量在添加配比2 的螯合剂时达到最高，为 109.6 mg·kg－1，为对照组的11倍。土壤有效态重金属Pb含量顺序依次为:配比2＞配比3＞EDTA＞EDDS＞配比1。土壤有效态重金属Cu在添加配比2的螯合剂时含量最高，达到1 369 mg·kg－1。土壤有效态重金属Cu含量顺序依次为:配比2＞EDDS＞配比1＞EDTA＞配比3。土壤有效态重金属Cd含量在添加配比1的螯合剂时达到最高，为59.4 mg·kg－1，是对照组土壤有效态重金属 Cd的5.5倍。植物对离子的吸收主要取决于溶液中该离子游离态的活度大小。然而，许多土壤中大部分金属在固相上，并且经常被非常牢固地结合。许多高产作物不像超富集植物那样具有自然富集金属的特征，不具有吸收大量金属的特性，所以需要向土壤中加螯合剂以增加土壤溶液中金属的浓度，促进植物对金属的吸收和富集［7］。对于如Pb、Cu等不溶性或难溶性金属，需要在植物生长介质中加入化学螯合物质来溶解释放不溶性的靶金属［8］。螯合剂对金属离子的螯合，在降低溶液中游离态金属离子活度的同时，也使土壤重金属从难溶性的形态转变为可溶性的形态，增加了土壤溶液中的金属浓度［6－8］。

与对照组相比，添加螯合剂的油菜组土壤有效态重金属含量具有不同程度增加(表3)。土壤有效态重金属Pb在添加配比2的螯合剂时含量是对照组的 5.2 倍，达到 300.5 mg·kg－1。土壤有效态重金属Cu含量在添加配比2的螯合剂时达到最高，为913 mg·kg－1。当添加配比3螯合剂时，土壤有效态重金属 Cd含量达到最高，为89.6 mg·kg－1，是对照组土壤有效态重金属镉的12.3倍。研究表明:投加EDTA和乙酸，与只使用EDTA比较，使印度芥菜对铅的积累量增倍，复合投加螯合剂表面活性剂相比单独投加时效果好［9］。Luo等［10］发现组合使用 EDTA 和 EDDS，会提高植物提取铜、铅、锌、镉的效率，与单独使用EDTA或EDDS时相比能达到一个更高的水平。Tandy等［11］认为出现这样结果是由于 EDTA和EDDS在植物提取金属的效率上存在差异，加入EDDS，使得EDTA捕获痕量金属的有竞争力的阳离子减少，如土壤可溶性钙Ca。但由于螯合剂表面活性剂与重金属形成水溶性胶体，增加了重金属在土壤中的可移动性，因此存在污染地下水的潜在风险。

表2 玉米植物内Pb、Cu、Cd的含量及其根部土壤中Pb、Cu、Cd的化学形态 mg·kg－1

表3 油菜植物内Pb、Cu、Cd的含量及其根部土壤中Pb、Cu、Cd的化学形态 mg·kg－1

2.2 EDTA/EDDS配比对植物重金属含量分布特征影响

添加不同配比EDTA/EDDS对植物地下部分重金属Pb、Cu、Cd累积量均有所增加(图1)。对于Pb而言，添加配比3的螯合剂时，对油菜地下部分重金属Pb累积量促进作用最为明显，达到5 473 mg·kg－1。玉米地下部分重金属Pb累积量在添加配比2的螯合剂时，促进作用最明显，达到4 201 mg·kg－1。对Cu而言，添加配比3的螯合剂时，对玉米和油菜地下部分重金属Cu累积量促进作用均最明显，玉米和油菜地下部分Cu累积量分别达到4 095、5 475 mg·kg－1。对 Cd 而言，当添加配比 3的螯合剂时，对玉米和油菜地下部分重金属Cd累积量促进作用均最明显，玉米和油菜地下部分Cd累积量分别达到48.93、103.38 mg·kg－1。

图1 EDTA/EDDS配比对玉米、油菜地下部分重金属 Pb、Cu、Cd 影响

添加不同配比EDTA/EDDS对植物地上部分重金属Pb、Cu、Cd累积量均有较大程度增加(图2)。对于Pb而言，添加配比3的螯合剂时，对玉米和油菜地上部分重金属Pb累积量促进作用均最为明显，达到632和793.6 mg·kg－1。对于 Cu而言，添加单一螯合剂EDDS时，对玉米地上部分重金属Cu累积量促进作用最明显，玉米地上部分Cu累积量达到1149 mg·kg－1。添加配比3的螯合剂时，对油菜地上部分重金属Cu累积量促进作用最明显，Cu累积量达到3874 mg·kg－1，是对照组Cu累积量的21倍。对Cd而言，当添加配比3的螯合剂时，对玉米和油菜地上部分重金属Cd累积量促进作用均最明显，玉米地上部分Cd累积量达到11.4 mg·kg－1，油菜地上部分累积量达到20.64 mg· kg－1。

图2 EDTA/EDDS配比对玉米、油菜地上部分重金属 Pb、Cu、Cd 影响

EDTA EDDS是羟基羧酸螯合剂，具有多齿状的配位基，能与重金属形成具有螯环的螯合物［12］。当EDTA-EDDS进入土壤后，与金属离子螯合形成金属－配位复合体，由于离子价数的减少或电性的变化，土壤对金属－配位复合体的吸持强度大大降低，为了维持固液相之间的平衡关系，金属从土壤颗粒表面解吸，从而增加了重金属的有效性［13］。

2.3 EDTA/EDDS配比对植物重金属迁移能力影响

S/R比值是植物地上部分重金属含量与根部重金属含量的比值，反映了重金属由植物根部吸收进入植物体内的迁移程度［14］。该值越大，说明植物对重金属的运输能力越强。螯合剂能增加土壤中重金属的溶解度，促进重金属自根系向地上部转运，当部分金属离子穿过细胞壁和细胞膜进入细胞后，能和细胞质中的蛋白质等形成复杂的稳定螯合物［14］。

从图3可以看出:加入螯合剂的植物S/R值均高于相应对照组植物S/R值。对于玉米而言，当添加单一螯合剂EDTA时，其地下部分含量重金属Pb输移系数S/R比值达到最高为0.19。当添加配比2的螯合剂时，其地下部分含量重金属Cu输移系数S/R比值达最高为0.39。当添加配比1的螯合剂时，其地下部分含量重金属Cd输移系数S/R比值最高为0.72。对于作物油菜而言，当添加螯合剂为配比3时，其地下部分含量重金属Pb和Cu输移系数S/R比值均达到最高，为0.34和0.7。当添加单一螯合剂EDTA时，其地下部分含量重金属Cd输移系数S/R比值最高为0.34。

根据 Reeve的观点［14］，S/R 的临界值为 0.5。如果植物的S/R值超过0.5，则说明该植物具备了修复土壤重金属污染的能力［8］。对于Cu而言，添加螯合剂为配比3时，植物体内重金属Cu的S/R系数达0.71。对于Cd而言，添加螯合剂为配比1时，植物体内重金属Cd的S/R系数达到0.6。本次添加不同螯合剂配比试验结果显示:螯合剂与重金属形成的螯合物可以直接进入植物体内，并有利于重金属从根部转运到地上部，从而大大增加了高生物产量作物对重金属的输移能力。

3 讨论

土壤作用过程是指螯合剂进入土壤后，将重金属从土壤颗粒上解吸到土壤溶液中，而土壤溶液是土壤中矿质离子、重金属离子以及植物根系直接作用的介质，因而大大增加了植物对重金属吸收的可能性。植物作用过程包括了植物根系对土壤溶液中重金属的吸收以及重金属在植物体内的转移和贮存。本研究通过添加不同配比的非生物螯合剂－生物螯合剂均不同程度增加了土壤有效态重金属的含量，促进了玉米和油菜对重金属pb、Cu、Cd的吸收。土壤有效态金属Pb、Cu含量，在添加螯合剂为配比2时均达到最高，分别为386.5和1369 mg·kg－1。属同分异构体的 EDTA和EDDS，当配位体过量时，EDTA的络合能力大于EDDS，而当过量的配位体减少时，EDDS对Cu的络合能力大于 EDTA。Tandy［11］研究表明:EDTA对Pb的螯合常数 logKs为17.88，而 EDDS的螯合常数logKs为12.7。

图3 EDTA/EDDS配比对不同植物重金属迁移能力S/R影响

魏岚［13］在研究中发现:EDDS处理下对茼蒿Cu含量和累积量促进作用最大，茼蒿地上部Cu含量和累积量分别达到973 mg kg－1。土壤有效态金属Cd在添加螯合剂为配比3时达到最高，为89.6 mg·kg－1。植物地下部分和地上部分 Pb、Cu、Cd生物累积量在添加螯合剂为配比3时达到最高。EDTA与EDDS的联合施用有效降低了单一螯合剂的施用量，能减少螯合剂对植物的毒害作用，避免植物生物量的减少。

重金属超富集植物仅有400多种，不足被子植物的0.2%，而且大部分超富集植物生物量小、生长缓慢，无法满足重金属污染土壤修复的需求。因此，需要培育生物量高、生长迅速、易于田间管理且对重金属有较高耐性的作物。但是这类植物对重金属的富集潜力十分有限，需要采用化学强化措施来提高提取修复潜力。本研究通过生物螯合剂EDDS与非生物螯合剂EDTA的联合使用，大大增加了高生物产量作物对重金属的输移能力，对于重金属Cu，S/R系数可以达到0.71，而对于Cd，S/R系数可以达到0.6，满足了植物修复重金属条件。

此外，高剂量人工合成剂会对植物产生毒害作用。添加单一螯合剂 EDTA为3 mmol·kg－1组，玉米和油菜表现尤为明显，植物出现发蔫、变黄现象，说明螯合剂的加入会影响到植物的正常生长［15－17］。金属跨根细胞膜进入根细胞共质体或木质部薄壁细胞的质膜装载进入木质部导管时，由专一性运输蛋白或通道蛋白调控。重金属一旦进入根细胞，可蓄积在根部或运输到地上部［18］。由于内皮层上有凯氏带，离子转入共质体后进入木质部导管，再进入根细胞质，导致游离离子过多，对细胞产生毒害，因而重金属可能与细胞质中的有机酸、氨基酸、多肽和无机盐结合，通过液泡膜上的运输体或通道蛋白运入液泡中。植物从根部吸收重金属并将其转移和积累到地上部。这个过程包括很多环节和调控位点［18］。总体来看，投加螯合剂虽然对植物和土壤特性有一定的影响，但有利于加速植物对土壤的修复，建议分次投加螯合剂以减弱其带给植物和环境的不利影响。

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