干细胞基因Oct4和Bcl-2在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达及意义

唐秋英，黄平，金瑛

（深圳市宝安区松岗人民医院妇产科，广东深圳518105）

·论著·

干细胞基因Oct4和Bcl-2在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达及意义

唐秋英，黄平，金瑛

（深圳市宝安区松岗人民医院妇产科，广东深圳518105）

目的探讨干细胞基因Oct4及Bcl-2在宫颈癌及其癌前病变中的表达及意义。方法采用HE、免疫组织化学、RT-PCR及Western blot检测Oct4及Bcl-2蛋白在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈原位癌及浸润癌(包括高分化、中分化、低分化)中的表达，并进行统计分析。结果Oct4在正常宫颈组织CIN宫颈癌组织中表达逐渐增加，其表达率依次为20%(2/10)、50%(15/30)、90%(18/20)。同样，Bcl-2在正常宫颈组织中的阳性表达率为10%(1/10)，在CIN中为40%(12/30)，而在宫颈癌中高达70%(14/20)。在正常宫颈组织、CIN及宫颈癌中Bcl-2的表达呈现逐渐增强的趋势，且在CINⅢ中Bcl-2表达高于CINⅠ/Ⅱ。Oct4和Bcl-2蛋白在正常宫颈组织、CIN及宫颈癌中的表达两两比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，但与宫颈癌病理类型无关。结论Oct4与Bcl-2参与了宫颈癌的发生及发展，Oct4和Bcl-2联合检测有助于为宫颈癌及癌前病变的临床诊治提供一定的理论依据。

宫颈癌；Oct4基因；Bcl-2基因；肿瘤干细胞

Oct4是保证哺乳动物胚胎发育有序地进行组织分化及个体发育的关键基因，其主要表达于胚胎干细胞、生殖细胞及未分化的胚胎癌肿中。近年来研究发现，上述Oct4基因可表达于多种成体干细胞中，与肿瘤的形成有密切关系。Bcl-2即B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因，是最早于B细胞白血病及滤泡型淋巴瘤的研究中发现的一种抑制细胞凋亡的基因，Bcl-2蛋白可表达于正常细胞的激活及发育过程中，也可表达于成熟组织中。本研究通过探讨Oct4与Bcl-2基因在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达状况，为两种基因作为潜在的癌干细胞标记物提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择我院2010年1月至2012年6月经病理科确诊的宫颈病变组织切片，包括正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈原位癌及浸润癌（包括高分化、中分化、低分化）各10例，收集新鲜标本并冷冻保存于-70℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCRTrizol法提取组织总RNA，以20 μl DEPC水溶解，RNA定量为110 g/L，在紫外分光光度计下测得波长为260 nm，280 nm处的吸光度(A)，其A值均在1.8～2.0。逆转录合成cDNA第一链，逆转录反应体系(20 μl)如下：DEPC水7.1 μl、5×反应缓冲液4.0 μl、dNTPs(10 mmol/L)1.0 μl、Oligo (dT)18(0.5 g/L)1.0 μl、RNA酶抑制剂0.5 μl、总RNA 5.6 μl、逆转录酶MuLV 0.8 μl。反应条件：70℃，5 min，速置于冰上；42℃，1 h；95℃，10 min灭活逆转录酶。PCR反应体系(25 μl)：cDNA模板2.5 μl、上下游引物(25 mmol/L)各0.5 μl、Taq聚合酶0.15 μl、dNTPs(10 mmol/L)0.5 μl、MgCl2(25 mmol/L)2.5 μl、10×Buffer 2.5 μl、ddH2O16 μl，95℃，45 s；57℃，30 s；72℃，60 s，35个循环，72℃延伸6 min。1.5%琼脂糖电泳鉴定产物，数码照相并行灰度值分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 HE染色石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色5 min，盐酸酒精分化后反蓝30 s，伊红染色3 min，经梯度酒精、二甲苯后中胜树胶封片。光镜下观察结果。

1.2.3 免疫组织化学染色采用SP法，石蜡切片3 μm，一抗分别用Santa公司浓缩型Oct3/4抗体(l:100稀释)及鼠抗人Bcl-2单克隆抗体，DAB显色，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。结果判断：细胞质中出现棕黄色颗粒为Bcl-2或Oct4阳性，高倍镜下随机观察10个视野，记录阳性细胞百分比，＜10%为阴性，＞10%为阳性。

1.2.4 Western blot检测宫颈上皮Oct4、Bcl-2的表达取冻存的宫颈上皮组织，分别加人膜蛋白裂解缓冲液0.5 ml，剪碎匀浆，提取总蛋白。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，用样品缓冲液将各样品浓度调至2 μg/μl，-20℃保存。蛋白样品用前煮沸5 min，12% SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转印到PVDF膜上，10%脱脂奶粉封闭2 h，分别用小鼠抗Oct3/4、兔抗Bcl-2抗体(1:400稀释)4℃孵育过夜，洗膜，10 min ×2次，过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、过氧化物酶小鼠抗兔IgG 1:1 000稀释，室温孵育2 h，同上洗膜2次，DAB显色。β-actin为内对照。

1.3 统计学方法所得数据应用SPSS for windows 13.0统计软件进行统计学描述与分析。计量资料用均数±标准差(x-±s)表示，进行t检验；计数资料进行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Oct4在正常宫颈组织中的阳性表达率为20% (2/10)，在CIN中为50%(15/30)，而在宫颈癌中高达90%(18/20）。在正常宫颈组织、CIN及宫颈癌中的表达呈现逐渐增强的趋势，且在CINⅢ中表达高于CINⅠ/Ⅱ。同样，Bcl-2蛋白阳性定位主要在胞质中，呈棕黄色颗粒，Bcl-2在上述三种组织中逐渐增加，且差异具有统计学意义，见表2。

表2 不同临床病理特征的宫颈组织bcl-2、Oct4的表达

表2 不同临床病理特征的宫颈组织bcl-2、Oct4的表达

注：经t检验、卡方检验，与正常宫颈组织比较，a,bP＜0.05；与CINⅠ/Ⅱ比较，cP＜0.05；与高中分化比较，dP＜0.05。

正常宫颈组织CIN t值/χ2值宫颈癌t值/χ2值CIN分级CINⅠ/ⅡCINⅢt值/χ2值宫颈癌原位癌侵润癌病理类型鳞癌腺癌病理分化高中分化低分化t值/χ2值10 30 20 0.36±0.03 0.67±0.08a2.11 1.79±0.11ab3.76 20(2/10) 50(15/30)a3.98 90(18/20)ab5.13 0.29±0.03 0.82±0.05a2.87 1.94±0.13ab3.89 10(1/10) 40(12/30)a4.22 70(14/20)ab4.78 20 10 0.58±0.04 1.87±0.12c3.79 30(6/20) 90(9/10)c4.94 0.48±0.04 1.97±0.14c3.88 20(4/20) 80(8/10)c4.85 10 10 1.83±0.11 1.84±0.13 90(9/10) 90(9/10) 1.58±0.10 2.12±0.14 60(6/10) 80(8/10) 16 4 1.52±0.10 1.39±0.09 94(15/16) 75(3/4) 1.45±0.09 1.59±0.11 75(12/16) 50(2/4) 11 9 0.62±0.05 1.85±0.11d3.69 27(3/11) 100(9/9)d5.02 0.81±0.12 1.59±0.14d3.14 36(4/11) 78(7/9)d4.64

3 讨论

Oct4是胚胎和生殖细胞肿瘤中常见的一种干细胞相关基因，它作为一种重要的转录因子在胚胎干细胞的调控中起着重要的作用，同时也在诱导多功能干细胞（IPS）的体外建立中发挥积极的作用。有文献报道，Oct4在非生殖系统肿瘤中也有表达[2-3]。本组资料通过对宫颈癌组织Oct4 RNA的检测，发现宫颈癌组织中Oct4基因表达较高，正常组织中Oct4基因的表达较为低，而在宫颈癌组织中Oct4的表达量与患者组织病理类型等并无较大相关性。其中正常宫颈组织、CIN和宫颈癌组织Oct4表达阳性率分别为20%、50%、和90%，阳性率逐渐升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，可见，Oct4基因在宫颈癌中转录并且表达，正常组织中其表达率及表达量均低于宫颈癌组织。提示，Oct4基因可能与宫颈癌干细胞有密切的关系。

Bcl-2基因是最早在B细胞白血病和滤泡型淋巴瘤的研究中发现一种细胞凋亡抑制基因，定位于染色体18q21，由于t(14；18)染色体易位以及转录后调节异常导致Bcl-2蛋白过度表达[4]。随后研究报道，Bcl-2的过度表达除了与淋巴造血组织肿瘤相关外，在非淋巴造血组织肿瘤的发生发展中也起着重要作用。有研究结果显示Bcl-2基因在CINⅢ级中的表达明显高于CINⅠ级和Ⅱ级，提示Bcl-2基因的过表达可能与癌前病变的发生即鳞状上皮进一步分化失败有关，是宫颈癌发生的早期事件[5]。本研究中，我们发现Bcl-2的表达在正常宫颈组织、CIN及宫颈癌组织中表达逐渐增强，且差异具有统计学意义，这就提示Bcl-2的过表达不仅是宫颈癌发病的早期事件，其也参与了宫颈癌病变的发展。

综上所述，Bcl-2和Oct4在宫颈癌组织中的表达与宫颈癌病理分化有一定的关联，Oct4与Bcl-2参与了宫颈癌的发生及发展，对Oct4和Bcl-2联合检测，有助于为宫颈癌及癌前病变的临床诊治提供一定的理论依据。

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[2]曹浩哲,冀静,郑鹏生.Oct4基因在宫颈癌中的表达及其意义[J].西安交通大学学报(医学版),2010,31(1):17-19.

[3]赵燕,孙志华.宫颈癌组织Nanog和Oct4的表达及临床意义[J].中华肿瘤防治杂志,2001,18(16):1243-1245.

[4]Soergel P,Loehr-Schulz R,Hillemanns M,et al.Effects of photodynamic therapy using topical applied hexylaminolevulinate and methylaminolevulinate upon the integrity of cervical epithelium [J].Lasers Surg Med,2010,42(9):624-626.

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Expression of stem cell gene Bcl-2 and Oct4 in cervical carcinoma and precancerous tissues and their clinical significance

TANG Qiu-ying,HUANG Ping,JIN Ying.Department of Gynaecology and Obstetrics,Shenzhen Songgang People's Hospital,Shenzhen 518105,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of stem cell gene Oct4 and Bcl-2 in cervical cancer and precancerous tissues,and to analyze the clinical significance.MethodsHE,immunohistochemistry,RT-PCR and Western blot were used to detect the levels of Oct4 and Bcl-2 protein in normal cervical tissue,and the tissue of cervical intraepithelial neoplasia(CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ),cervical carcinoma in situ and invasive carcinoma(well differentiated,moderately differentiated,poorly differentiated).The results were statistically analyzed.ResultsThe expression of Oct4 gradually increased in normal cervical tissue,CIN,and cervical carcinoma,with the expression rates of 20%(2/10),50%(15/30),90%(18/20),respectively.The expression rate of Bcl-2 was 10%(1/10)in normal cervical tissue,40%(12/30)in CIN,and up to 70%(14/20)in cervical carcinoma,which was higher in CINⅢthan CINⅠand CINⅡ.The expression of Oct4 and Bcl-2 protein showed statistically significant difference between normal cervical tissue,CIN and cervical carcinoma(P＜0.05),but has nothing to do with the pathological type.ConclusionOct4 and Bcl-2 may take part in the occurrence and development of cervical carcinoma.Combined detection of Oct4 and Bcl-2 provides useful information for the early diagnosis and treatment of cervical carcinoma.

Cervical carcinoma;Oct4;Bcl-2 gene;Cancer stem cells

R737.3

A

1003—6350(2013)05—0625—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.05.0270

2012-10-30)

2010年度深圳市科技计划项目（编号：201003382）

唐秋英。E-mail：tangqiuying@163.com