外加营养源作用下砖红壤中五氯酚还原转化的 生物化学作用机制

陈曼佳，刘承帅，吴伟坚，童辉，李芳柏*

1. 中国科学院广州地球化学研究所，广东 广州 510640；

2. 广东省农业环境综合治理重点实验室，广东省生态环境与土壤研究所，广东 广州 510650；3. 中国科学院大学，北京 100039

五氯酚（pentachlorophenol，PCP）是自然界中普遍存在的高毒、难降解的持久性有机氯污染物，在过去的30年中，五氯酚被广泛应用于杀虫、杀菌、防腐等生产生活领域[1-2]。PCP的大规模使用已经造成了湿地、水体、土壤等大范围的污染，并威胁到人类的健康[3-5]。

氯酚在缺氧土壤环境中经历着缓慢的自然还原转化过程[6-7]，包括非生物和生物转化过程。氯酚在土壤中的非生物转化通常是由各种潜在氧化还原剂引起，尤其是含低价态铁及其铁氧化物等自然矿物界面[6]。微生物在土壤地球化学过程中扮演着极其重要的角色。早在1986年，Valo和Salkinoja-salonen报道了Rhodococcus chlorophenolicus对土壤中苯氧基苯酚和多氯苯氧基苯甲醚进行还原脱氯[8]。土壤中氯酚还原转化通常既发生生物转化，又同时伴随着非生物转化[9-10]。在厌氧土壤环境中，非生物和生物过程可能共同促进氯酚的还原转化过程。

在厌氧富铁红壤中，吸附态Fe（Ⅱ）被认为是PCP还原转化的活性物种[11-13]。但是，在土壤环境中的铁大部分是以含铁土壤矿物组成成分的形式存在，很难直接作用于PCP的还原转化。在厌氧条件下，土壤氧化铁能够通过还原性有机酸 [14-15]和异化铁还原微生物驱动等作用产生大量的土壤矿物吸附态Fe（Ⅱ）物种[16]，从而促进土壤中有机氯污染物的还原转化。

玄武岩砖红壤是广东省热带地区代表性土壤，其铁氧化物和有机质的含量都较高[17]，因此，玄武岩砖红壤中PCP具有活跃的环境地球化学过程，同时，其中的微生物群落结构也与PCP转化具有密切关系。但是，与之相关砖红壤中PCP转化的微生物作用过程机制，还需进一步研究。

因此，本研究以玄武岩发育的砖红壤为基质，在中性厌氧环境下，系统研究PCP还原转化过程及其微生物群落结构的变化，在此基础上深入探讨红壤体系对PCP的消减能力及反应机制，为促进土壤中有机氯污染物的还原转化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤样品为玄武岩砖红壤，采自广东省雷州市唐家镇（20°51′N, 109°53′E），按多点采样的方式采集深度为0~15 cm的土壤，土壤样品在实验室自然风干后，去除动植物残体，过0.180 mm筛。供试土壤的理化性质经常规分析方法分析：土壤pH 4.79，有机质含量25.1 g/kg，总铁137.27 g/kg，络合态铁0.076 g/kg，无定形铁1.879 g/kg，游离态铁16.97 g/kg。

1.2 实验设计

实验设计见表1，反应体系为0.5 g土壤（干质量），PCP、哌嗪-1,4-双（2-乙烷磺酸）（PIPES）、乳酸和蒽醌-2,6-磺酸钠（AQDS）的初始浓度分别为0.019、30、10和0.2 mmol·L−1。通过PIPES缓冲溶液将pH值控制在7.0左右。反应体系在20.2 mL的西林瓶中进行，高纯氮气充气30 min排氧，然后用橡胶塞压紧并用铝盖密封。样品置厌氧培养箱中（30 ± 1）℃静置培养，每隔一定时间取样，测定样品中目标物、吸附态Fe（Ⅱ）、氧化还原电位、胞外电子传递数量以及微生物群落结构。每个样品设置3个重复，文中所示数据均为数据平均值。

表1 实验设计条件 Table 1 Experimental design

1.3 实验方法

反应体系样品中目标物PCP采用1:1 (V:V)乙醇水溶液进行提取后[18]，高效液相色谱（HPLC）测定；吸附态Fe(Ⅱ)由0.5 mol·L−1盐酸提取[16]，其浓度采用分光光度计测定，活性铁物种的氧化还原电位（Ep）采用循环伏安法（CV）与传统的三电极体系测试[19]，胞外电子传递数量采用微生物燃料电池(MFC)的方法进行测定[19]。具体的测试方法及过程见参考文献[20]。土壤灭菌处理采用γ射线辐照灭菌（60Co源，辐照剂量为50 kGy）[21]。

1.4 微生物群落结构分析方法

1.4.1 土壤DNA提取

土壤DNA提取采用MO BIO公司的PowerSoilTMDNA试剂盒进行提取，具体步骤参照试剂盒说明书进行。

1.4.2 细菌16S rRNA片段的PCR扩增和纯化

采用通用引物扩增细菌16S rRNA。正向引物为27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′），反向引物为1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），其中正向引物5′用6-羧基二乙酸荧光素（FAM）标记，用于末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）实验。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成标记。PCR的反应体系如下：总体积25 μL，其中Ex Taq DNA聚合酶（TAKARA）1 U，聚合酶缓冲溶液2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，正反向引物各0.4 μmol·L−1，模板50 ng，补充无菌水至25 μL。PCR反应条件如下：94 ℃ 4 min，30个循环为：94 ℃ 1 min；55 ℃ 1 min；72 ℃ 1.5 min；72 ℃最终延伸10 min。PCR产物用纯化试剂盒（OMEGA）纯化，具体方法流程按照说明书进行。

1.4.3 末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）试验

末端荧光标记的PCR纯化后产物用MspI（TAKARA）限制性内切酶进行消化，反应体系为20 μL，其中酶8 U，10 × buffer 2 L，DNA 200 ng，37 ℃下消化3 h，然后升温至70 ℃将酶灭活20 min。酶切产物的T-RFLP分析由上海基康生物技术有限公司完成。T-RFLP图谱中限制性片段（T-RF）在50 ~ 550 bp，丰度小于1%的T-RFs不计入计算。T-RFs定性分析采用网站在线分析（http：//trflp.limnology.wisc.edu/index.jsp），选择在线分析中的PAT（The T-RFLP Phylogenetic Assignment Tool）工具。

2 结果与讨论

2.1 PCP转化动力学

图1 不同反应条件下PCP还原转化动力学 Fig. 1 Reductive transformation kinetics of PCP

PCP在玄武岩砖红壤中的还原转化动力学如图1所示。由图可知，在灭菌体系中（SC处理），PCP没有发生还原转化。其他3个体系中，PCP的还原转化速率依次为T3>T2>T1。在只有PIPES作为缓冲溶液的体系下（T1处理），反应90 d之后，大约有10.8%的PCP发生转化，其转化一级动力学常数k为4.5 × 10−3d−1（R2= 0.943）。结果说明了土壤中的微生物对PCP的还原转化起着决定性作用。有文献[22-24]报道，通过生物刺激的作用，可以提高土壤中土著微生物的活性，从而进一步提高有机氯污染的脱氯转化。在本研究中，当添加外加营养源乳酸作为电子供体时（T2处理），PCP转化速率得到提高，17.5%的PCP发生转化（k = 7.3 ×10−3d−1，R2= 0.947）。当同时添加乳酸和电子介体AQDS时（T3处理），PCP的转化速率进一步提高，30.2%的PCP发生转化（k = 14.3×10−3d−1，R2= 0.958）。结果表明，在外加营养源作用下，供试砖红壤中微生物活性提高，同时，电子介体能提高反应体系中电子传递速率，从而提高PCP的还原转化速率。

2.2 吸附Fe(Ⅱ)生成动力学

Li等[11-12]研究表明，土壤中铁物种的地球化学循环过程能影响PCP还原转化过程，还原性Fe(Ⅱ)物种能够显著促进PCP还原转化率。本研究供试土壤样品具有较高的总铁以及各种形态的铁含量，因此本研究系统考察了PCP降解过程中活性铁物种的生成动力学，进一步研究铁物种对PCP转化的影响。图2为反应过程中产生的吸附态Fe(Ⅱ)浓度变化。从图中可以看出，在灭菌体系中，产生的吸附态Fe(Ⅱ)最高浓度只有0.18 mmol·L−1。而随着反应时间的增加，T1-T3体系中，吸附态Fe(Ⅱ)浓度呈现持续上升趋势，说明添加电子供体乳酸能促进吸附态Fe(Ⅱ)物种的形成，而加入电子介体AQDS能进一步提高体系当中Fe(Ⅱ)生成量。

图2 PCP还原转化过程中吸附态Fe(Ⅱ)生成动力学 Fig. 2 Adsorbed Fe(Ⅱ) generation during the PCP transformation

2.3 反应体系中氧化还原电位的变化

采用循环伏安法测定了T1-T3反应体系中前10天活性铁物种的氧化还原电位Ep，结果如图3所示。T1体系中，在反应后期Ep值没有明显变化；而T2和T3体系中，随着反应时间的增加，其Ep值不断变小。这表明在T2和T3体系中，活性Fe(Ⅱ)物种的数量不断增多，反应体系的还原能力持续提高。Glass等[25]指出，土壤的氧化还原电位越低，土壤有机氯污染物的还原转化速度越快，而还原态的Fe物种是影响淹水土壤中氧化还原状态的重要因素之一。由此可见，T3处理中生成的吸附态Fe(Ⅱ)具有较强的还原能力，这也是T3体系中具有较高的PCP还原转化效率的主要原因。

图3 PCP还原转化过程中氧化还原电位变化 Fig. 3 Change of redox potential (Ep) generated during the PCP transformation processes

2.4 PCP转化过程中土壤微生物群落结构变化

图4 4个不同处理下土壤微生物的T-RFLP分析结果 Fig. 4 T-RFLP analysis of bacteria in four treatments

前面研究结果表明，在PCP还原脱氯过程中，土壤样品中微生物起到重要的作用。因此，本研究采用T-RFLP方法对反应7 d的T1-T3体系中微生物群落结构进行解析。实验过程设计不加PCP的处理（CK处理）供试土壤作为对照，研究PCP对微生物群落结构变化的影响。采用MspⅠ进行酶切，酶切产生的片段类型统计结果如图4所示，其中片段丰度小于5%的所有片段归为一类（图中others所示），丰度大于10%定义为该处理条件下的优势种群。CK处理下，共检测到14个T-RF片段；T1-T3处理,分别检测到10、7和4个T-RF片段。具体每个T-RF代表物种类型及丰度如表2所示。

表2 T-RFLP图谱分析不同处理下土壤细菌主要种群 Table 2 Dominating bacteria based on T-RFLP profiles by PAT T-RFLP program

CK处理下，微生物群落结构的多样性最高，其优势种群为477 bp和484 bp，分别与根瘤菌和梭菌末端片段一致；T1处理下，其优势种群为120 bp和484 bp，分别与脂肪酸芽孢杆菌和梭菌末端片段一致；T2处理下，其优势种群为484 bp和518 bp，均与梭菌末端片段一致；T3处理下，其优势种群为286 bp和288 bp，均与梭菌末端片段一致。由此可以推测，在供试土壤样品中，梭菌是绝对优势种群，尤其是添加乳酸和AQDS之后，其含量超过30%；由表2同时可知，T2处理中的片段509 bp与希瓦氏菌（典型铁还原菌）片段一致。结果说明，在外加营养源作用下，与对照处理相比，铁还原菌丰度增加。对4个处理下微生物群落结构进行主成分分析（PCA）发现[26]，在研究的4个不同处理条件下，其微生物群落结构存在明显差异（图5），第一主成分主要把添加PCP的样品点与对照试验点分开。T1-T3处理，其差异性主要表现在第二主成分。

图5 4个不同处理下微生物群落结构主成分分析 Fig. 5 Principal component analysis of microbial community in the four treatments

3 结论

在玄武岩砖红壤中，存在一定丰度的希瓦氏菌，厌氧条件下，氧化铁能被还原形成吸附态Fe(Ⅱ)物种，吸附态Fe(Ⅱ)是土壤有机氯还原转化的重要活性物质[11-12,27]。乳酸作为电子供体，为微生物提供可利用碳源[22]，外加乳酸时，土壤中的希瓦氏菌的丰度有所增强，促进了土壤中吸附态Fe(Ⅱ)的形成，从而提高了PCP的还原转化率。

醌基类物质如腐殖质和AQDS作为电子介体，能提高体系的电子转移速率[28]。因此，砖红壤反应体系中加入AQDS能显著提高PCP的还原转化率。

玄武岩砖红壤中PCP还原转化的活性物质是吸附态Fe(Ⅱ)，希瓦氏菌是土壤中吸附态Fe(Ⅱ)生成的驱动者。添加乳酸和AQDS促进了吸附态Fe(Ⅱ)的生成，从而加速PCP的还原转化。

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