补肾阳复方激活肾上腺皮质类固醇合成酶的研究

曾洋 黄建华 孙伟 马方励 夏世金

肾阳又被称为元阳，在机体功能调节中占有重要的地位。肾阳虚证是指由于肾阳虚衰、温煦失职、气化失权所表现的一类虚寒证候。肾阳虚的现代研究发现肾阳虚患者特异性具有肾上腺皮质功能或储备功能低下，补肾阳药可对肾阳虚患者下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴功能进行调节，我们以往的研究以及其他报道显示补肾阳升高血浆皮质酮水平［1-3］，为深入研究其机制，本研究组首先采用基因芯片在全基因组范围内筛选补肾阳药物作用后的差异表达基因，发现补肾阳药能提高多个类固醇合成酶的mRNA 表达，对此进一步用实验验证，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 自拟补肾阳复方(由巴戟天、枸杞、桂枝组成)粉末由无限极中国有限公司提供，组成比例为5 ∶4 ∶1。皮质酮购自Sigma 公司;类固醇合成酶免试剂盒购自Caymen 公司。

1.2 动物分组及一般处理 30 只雄性SD 大鼠，体质量(200 ±6)g，随机分为对照组、模型组、自拟补肾阳复方组(复方组)，每组10 只。动物先适应喂养5 d，模型组、复方组第6 天开始给予10 mg/kg 皮下注射皮质酮，对照组以等体积灭菌橄榄油代替皮质酮注射。另外复方组将自拟补肾阳复方粉末混悬于生理盐水，并按292 mg/(kg·d)灌胃;对照组和模型组等体积生理盐水灌胃。

1.3 血浆皮质酮和促肾上腺皮质激素(ACTH)浓度检测 实验结束，取血浆，采用ELISA 方法检测，具体方法按Caymen 公司试剂盒说明。取样品10 μl，加40 μl 缓冲液(稀释5 倍)，除空白孔，每孔加入50 μl Tracer 和50 μl 一抗。室温(23 ℃)，在摇床上孵育2 h，孵育完毕洗板5 次。每孔加入200 μl Ellman＇s Reagent，避光，在摇床上孵育75 min，孵育完毕，用酶标仪在412 nm 波长，读取OD 值，计算浓度。

1.4 基因芯片检测 实验结束，取肾上腺，提取总RNA，NanoDrop ND-1000 测定浓度，标准变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。每个样本取5 μg 总RNA 用于标记和微阵列杂交。用Invitrogen Superscript ds-cDNA synthesis kit 进行逆转录反应。用NimbleGen one-color DNA labeling kit 进行ds-cDNA 标记。用NimbleGen hybridization system 进行微阵列杂交，用NimbleGen wash buffer kit 进行洗涤。用Axon GenePix 4000B microarray 扫描仪(Molecular Devices Corporation)进行阵列扫描。扫描图像(TIFF 格式)导入到NimbleScan 软件(2.5 版)进行栅格匹配和数据分析。原始数据采用百分位数法进行归一化，并形成探针水平信号强度和基因水平信号强度。基因水平信号强度导入Agilent GeneSpring GX 软件(11.5.1 版)进行进一步分析。差异表达基因经t 检验，P ＜0.05 筛选。信号通路、gene ontology 分析采用DAVID 在线程序。1.5 蛋白印迹 实验结束，取肾上腺，称重，计算肾上腺质量指数(肾上腺质量/体质量)。然后称取20 mg，加入细胞裂解液100 μl(含PMSF 1 mmol/L)，匀浆，冰上静置5 min，1300 r/min 离心5 min，取上清，采用BCA 法检测蛋白浓度。按试剂盒说明书配制12%SDS-PAGE 分离胶，配5%浓缩胶，每孔加样总蛋白量为35 μg，70 V 恒压电泳2 h，11 V 恒压转膜过夜，取出印记膜，室温封闭1 h，用一抗稀释液按1 ∶200 稀释一抗，室温孵育1 h，二抗稀释液按1 ∶5000 稀释二抗，室温孵育1 h 后，洗涤，按说明书加入ECL 化学发光液，室温孵育3 min，去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X 光胶片曝光。

1.6 统计学分析 除基因表达数据，其他数据均采用均数±标准差表示，采用SPSS 15.0 for windows 软件包对样本进行单因素方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠体质量变化比较 在造模前，各组大鼠体质量差异无统计学意义(P ＞0.05);在造模第7 天时，模型组大鼠体质量与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.01)。复方组体质量与模型组比较明显升高(P ＜0.01)，差异有统计学意义，但与对照组比较没有统计学差异(P ＞0.05)。造模第14 天时，模型组和复方组体质量与对照组比较显著降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，复方组与模型组比较，则显著升高(P ＜0.05)。见表1。

表1 3 组大鼠体质量变化比较(±s，g，n=10)

表1 3 组大鼠体质量变化比较(±s，g，n=10)

注:与对照组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别造模前造模第7 天造模第14天203.50 ±3.34305.75 ±7.21337.75 ±6.54模型组200.25 ±3.28266.00 ±10.80＊＊303.50 ±14.13＊＊复方组199.45 ±3.52295.50 ±8.35△△320.00 ±10.15对照组＊△

2.2 3 组大鼠肾上腺质量及肾上腺质量指数比较模型组及复方组大鼠肾上腺质量较对照组明显下降(P＜0.01)，复方组较模型组明显升高(P ＜0.05)。3 组间大鼠肾上腺质量指数差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

2.3 3 组大鼠血浆皮质酮、ACTH 水平的比较 与对照组比较，模型组血浆皮质酮和ACTH 显著降低(P ＜0.01)。与模型组比较，复方组血浆皮质酮和ACTH含量显著升高(P ＜0.05)。见表2。

表2 3 组大鼠肾上腺质量及指数、血浆皮质酮及ACTH 浓度变化比较(±s，n=10)

表2 3 组大鼠肾上腺质量及指数、血浆皮质酮及ACTH 浓度变化比较(±s，n=10)

注:与对照组比较，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05

组别肾上腺质量(mg)肾上腺质量指数血浆皮质酮浓度(ng/ml)ACTH(ng/ml)对照组49.63 ±6.000.15 ±0.0216.22 ±5.37324.46 ±132.92模型组28.88 ±9.45＊＊0.10 ±0.035.50 ±4.25＊＊150.25 ±60.54＊＊复方组35.57 ±7.53＊＊△0.11 ±0.0211.40 ±6.34△330.57 ±224.05△

2.4 基因芯片结果

2.4.1 差异基因情况:所有差异表达基因均为差异调节2 倍以上，组间比较差异有统计学意义(P ＜0.01)。模型组与对照组比较，1098 个基因上调;补肾复方作用后，共有1135 个基因下调，其中模型组上调的基因表达被逆转的有735 个。模型组与对照组比较，603 个基因下调;补肾复方作用之后，共有477 个基因上调，其中模型组下调的基因表达被逆转的有93 个。这些基因组间的基因表达模式被明显逆转。

2.4.2 被补肾复方逆转的基因信号通路分析:为进一步探索保护HPA 轴的功能，我们对被补肾阳复方逆转的828 个基因进行了信号通路分析。结果发现在被补肾复方调节的基因富集的信号通路中，有2 个引起了我们的重视:MAPK 信号通路和类固醇合成通路。见表3。

表3 补肾复方逆转的基因富集的信号通路

2.5 补肾阳复方提高类固醇合成酶蛋白表达 各组动物HSD11B1、CYP7A1 蛋白印迹实验显示，模型组这2 种蛋白表达降低，而自拟补肾阳复方作用后，HSD11B1 的表达水平明显升高，但对CYP7A1 表达的上调作用不明显。见图1。

3 讨论

大剂量糖皮质激素长期应用对机体多方面产生药理效应，如激活肝脏糖原分解酶使糖原分解加速，血糖升高;激活脂肪分解酶使脂肪分解加速，血脂升高;与淋巴细胞中糖皮质激素受体(GR)结合，发挥抗炎症的效应，诱导淋巴细胞凋亡［4-5］。超过一定量的血浆糖皮质激素水平也通过负反馈抑制下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)分泌，进而抑制垂体ACTH 分泌，导致机体内肾上腺自身分泌糖皮质激素长期减少，并且长期大剂量糖皮质激素的反馈抑制使HPA 轴发生形态学改变，如下丘脑CRH 神经元减少，肾上腺皮质细胞凋亡及肾上腺萎缩［6-7］，高水平的糖皮质激素还会引起免疫系统的抑制和胸腺淋巴细胞凋亡［8］。

图1 补肾阳复方对有关类固醇合成酶表达的作用

国际上已有研究探索如何促进HPA 轴恢复，但仍未取得成功。Markowska 等［9］报道一个十肽Pneumadin(PNM)，通过促进精氨酸加压素(AVP)和ACTH 的释放，防止肾上腺皮质细胞数量和体积的减少，可增加肾上腺组织皮质酮和醛固酮的含量，但不能引起2 种激素血浆水平的变化。Maces 等［10］在应用地塞米松后的抑郁患者中发现5-羟色胺1A 受体兴奋剂丁螺旋酮能升高血浆ACTH 和可的松浓度，并提出丁螺旋酮通过促进ACTH 合成和释放使应用地塞米松后的抑郁患者免于HPA 抑制，但作为抗抑郁药，丁螺旋酮能否用于其他HPA 轴受抑情况还没有相关报道。本研究中，我们观察到补肾阳复方能升高模型鼠肾上腺质量、升高血浆皮质酮的水平，提示具有提高HPA 轴功能的作用。

本研究我们采用基因表达谱对补肾阳复方保护肾上腺皮质功能的机制进行了初步探索，结果发现在皮质酮造成的基因表达改变中，补肾复方逆转了828 个，包括在模型组上调，后被补肾阳复方下调的;也包括在模型组下调，后被补肾阳不放上调的。我们认为这些基因可能是补肾阳复方发挥作用的候选基因。信号通路分析结果有2 条通路引起了重视，一是MAPK 信号通路，有11 个基因属于该通路，特别是其中的FGFs，研究表明对肾上腺皮质的再生起着关键作用［11］，该通路上调为实验中观察到补肾阳复方能提高肾上腺质量的结果可能提供了一种解释。另外一条通路是类固醇合成通路，共有6 个基因被上调，均是皮质酮生物合成中的各种酶，因此我们进一步采用western blot 检测HSD11B1、CYP7A1 蛋白的表达，发现补肾阳复方对HSD11B1 蛋白表达确有提高作用，这一结果为补肾阳复方升高血浆皮质酮水平提供了部分解释。

在实验中，我们还观察到补肾阳复方对动物体质量均有明显的保护作用。在造模第7 天时，造模组大鼠体质量与对照组比较显著下降，而补肾阳药物治疗组体质量与正常对照组比较差异无统计学意义，表现了对皮质酮大鼠体质量具完全保护作用。造模第14天，我们也发现对大鼠体质量具有保护作用，这些在器官水平的结果提示补肾阳药物不仅对HPA 轴，而且对糖皮质激素造成的过度分解代谢状态具有保护作用。关于拮抗糖皮质激素促分解代谢的不良反应，国外有一些研究报道［12-13］，补肾阳中药在这些方面表现了显著效果，其具体机制值得深入研究。

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