高效液相色谱法测定复方消渴降糖胶囊中槲皮素含量

2013-07-28夏爱军廖厚知

中国药业 2013年4期

季波，夏爱军，廖厚知

（1.中国人民解放军广州军区广州总医院药剂科，广东广州 510010； 2.中国人民解放军第303医院药剂科，广西南宁 530021； 3.广西汇科药物研究所，广西南宁 530007）

复方消渴降糖胶囊为在研中药六类新药，由番石榴叶、天花粉、生地、山药、山茱萸、麦冬、五味子等7味药组方，具有清热生津、除烦止渴的作用，用于热病津伤口渴，多饮、多尿、多食、消瘦、体倦无力、尿糖及血糖升高之消渴症。番石榴叶为处方中君药，为桃金娘科植物番石榴 Psidium guajavae L.的干燥叶[1]，具有生津止渴、甘平养胃、敛涩固阴的功效，主要有效成分为黄酮类、番石榴苷[2]、槲皮素、β－谷甾醇、无色矢车菊素、长生苷、番石榴酸及挥发油丁香油酚等[3]，在中外民间均有广泛使用，主要用于降血糖、调血脂、抗病毒、抗菌、抗氧化及收敛止血等方面[4]。现采用高效液相色谱（HPLC）法测定槲皮素的含量，并对其测定方法进行了研究[5－6]。

1 仪器与试药

LC－2010A型高效液相色谱仪（日本岛津）；SPD－M10Avp紫外检测器（日本岛津）；AB265－S型分析天平（；梅特勒－托利多）；UV－2450型分光光度计（日本岛津）。槲皮素对照品（批号为10081－99050，中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯，盐酸、磷酸均为分析纯；复方消渴降糖胶囊（批号分别为20100601，20100602，20100603，20100801，20100802，20100803）及缺番石榴叶的阴性样品(自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:VP － ODS C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相:甲醇－ 0.2% 磷酸溶液（50 ∶50）；流速:1.0 mL ／min，柱温:室温；检测波长:360 nm。理论板数按槲皮素计不低于4000，此条件下槲皮素与其他成分分离度不低于1.5。

2.2 溶液制备

精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得对照品溶液。取本品10粒，精密称定，研匀，取0.5 g，精密称定，置 100 mL 锥形瓶中，加甲醇－2.5 mol／L 盐酸溶液（4 ∶1）50 mL，水浴加热回流 30 min，放冷，移至100 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得供试样品溶液。取缺番石榴叶的阴性样品0.5 g，精密称定，按样品溶液的制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验:分别精密吸取2.2项下3种溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按确定的色谱条件测定，在此条件下样品中槲皮素与其他组分达到基线分离，分离度大于1.5，理论板数按槲皮素峰计算大于4000，保留时间约为13 min，阴性无干扰，见图1。

线性关系考察:精密称取槲皮素对照品10.12 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取 1，2，3，4，5 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件，分别进样 20 μL，测定，以峰面积积分值 Y对槲皮素进样量X（μg）进行回归分析，得回归方程 Y＝2387389 X－4767，r＝0.9999。结果表明，槲皮素进样量在 0.2024 ～1.0120 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取同一对照品溶液（30.36 μg ／mL），按上述色谱条件，依法操作测定，重复进样6次，测定色谱峰面积，计算RSD值为0.92%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品（批号为20100601）溶液10 μL，在 2，4，6，8，24，48，72 h 时间隔进行分析，测定色谱峰面积，计算 RSD值为0.89%，表明供试品溶液制备后72 h内稳定。

重复性试验:取同一批号样品6份（批号为20100601），依法制备供试品溶液并测定含量。结果平均含量为 2.581 mg／粒（5.140 mg／g），RSD 为 1.17% ，表明方法重复性好。

图1 高效液相色谱图

加样回收试验:取已知准确含量（5.140 mg／g）的样品 6份（批号为 20100601），每份取 0.25 g，精密称定，置 100 mL 量瓶中，精密加入 1 mL槲皮素对照品溶液（1.254 mg／mL），挥去甲醇，按供试品溶液制备方法制备，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件下测定槲皮素峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 槲皮素加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取复方消渴降糖胶囊6批，按上述方法测定，结果见表2。

3 讨论

文献[7－8]中曾采用含有盐酸的甲醇溶液提取槲皮素测定含量。本试验在供试品溶液的制备时，参考了上述文献，考察了甲醇－盐酸超声提取、甲醇－盐酸回流提取，结果甲醇－盐酸超声提取水解不完全，甲醇－盐酸回流提取、水解好、提取完全，可达到试验目的。在流动相的选择上，探讨过甲醇－0.2%磷酸水溶液（60 ∶40）、甲醇－0.2% 磷酸水溶液（55 ∶45），结果分离度小于1.5未能达到要求；甲醇－0.2%磷酸水溶液（50∶50），分离度大于 1.5，出峰时间约为 13.5 min，达到了试验要求。