乳制品中非法保鲜剂硫氰酸钠检测方法的研究

蔡如繁，茹巧美，何晋浙

(浙江工业大学 生物与环境工程学院食品系,杭州310014)

0 引 言

乳制品是一种营养丰富，老少皆宜的产品，在我们的生活中不可或缺。自三聚氰胺事件之后，国家对于乳制品的安全问题格外重视。近来，卫生部发布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)》，公布一种乳制品非法保鲜剂，即硫氰酸钠。硫氰酸钠在牛奶或奶粉中掺入后可有效抑菌、保鲜。但硫氰酸钠是毒害品，一般用于工业制造，人体少量的食入就会造成极大伤害。而且，目前尚无食品中硫氰酸钠检测的国家标准或行业标准[1]，是乳品质量安全的一大漏洞。因此，建立乳品非法保鲜剂的检测分析方法，并对市场上常见品牌的乳品进行风险评估研究，对我国的奶业发展和人民身体健康具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

V-1800 PC型紫外分光光度计，Agilent 1260 Infinity高效液相色谱系统，ICS-2000离子色谱系统，配备电导检测器，高速冷冻离心机，KQ5200ZE型数按超声波清洗器，METTLER AE240电子分析天平，Millipore超纯水发生器，RP柱。

1.2 原料与试剂

市售6种牛奶与6种奶粉品牌。

硫氰酸钠储备液(质量浓度1 000 mg/L)：准确称取0.1 g硫氰酸钠 (精确到0.0001)用纯水定容到100 mL；硫氰酸钠工作液：用纯水将硫氰酸钠储备液逐级稀释得到。

硝酸铁溶液(质量浓度50 g/L)：称取25 g Fe(NO3)·9H2O溶于200 mL水中，加入25 mL浓硝酸，用水定容到1 000 mL的容量瓶中；Triton-X-100溶液 (200 g/L)：称取20 g Triton-X-100，用水定容到100 mL的容量瓶中。

乙腈(色谱纯)；

浓度为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=7)：称取3.5814 g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)溶于500 mL容量瓶，1.5601 g磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O) 溶于500 mL容量瓶，再将磷酸氢二钠∶磷酸二氢钠=500∶320按比例混匀，制的磷酸盐缓冲液。

1.3 分析方法

1.3.1 样品前处理

称取5.0 g奶粉或吸取5.0 mL牛奶于50 mL的具塞比色管，加入15 mL水，密塞振摇均匀，在70℃下超声提取10 min，冷却后加入25 mL乙腈[2]，再超声20 min，最后用水定容到50 mL。然后至高速冷冻离心机中，4℃下15 000 r/min离心20 min，小心取出全部上清液，过0.45 μm的有机滤膜，待测。

1.3.2 紫外分光光度法

吸取5 mL经过前处理的奶粉样品滤液，加入4 mL硝酸铁溶液和4 mL Triton-X-100溶液，用水定容到25 mL，摇匀，暗处放置2 min后在465 nm下测定吸光值，以样品空白做参比。根据标准曲线可得样品中的硫氰酸钠质量浓度[3]。另外，分光光度法不适合液奶的检测。

1.3.3 液相色谱法

色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×150mm，5 μm)；流动相为磷酸盐缓冲液∶乙腈=95∶5；流速为1 mL/min；紫外检测波长为218 nm；柱温为30℃；进样量为10 μL。

在上述色谱条件下，对标准工作液、样品溶液、空白溶液分别进样测定，样品滤液上机前要过0.22 μm的针式滤膜。根据标准曲线可得样品中硫氰酸钠的质量浓度。

1.3.4 离子色谱法

色谱柱：IonPac AS19分析柱 (4 mm×250 mm)和AG19保护住(4 mm×50 mm)；流动相：KOH溶液(由淋洗液发生器生成)，浓度为50 mmol/L等度淋洗；流速为1.00 mL/min；抑制电导检测器：ASRS-300(4 mm)型抑制器，抑制电流 124 mA；柱温为30℃；电导池温度为35℃；进样量为25 μL。

经过前处理的样品溶液还要经过OnGuard RP柱(RP柱活化：用 5 mL甲醇冲洗，再用10 mL去离子水冲洗，放置20 min)[4]，弃去前面流出的1/3体积，收集余下的流出液，再进样检测。

在上述色谱条件下，对标准工作液、样品溶液进样测定，根据标准曲线可得样品中硫氰酸钠的质量浓度。

2 结果与分析

2.1 紫外分光光度法

2.1.1 显色剂用量的确定

硫氰酸钠能与三价铁离子发生反应，生成硫氰酸铁络合离子[5]。试验初期采用硫酸铁氨作为显色剂，但是硫酸铁氨不稳定，而且硫酸铁氨本底颜色较深。硝酸铁本底颜色浅，可作为显色剂使用，但显色剂的加入量对显色效果有明显的影响，见表1。

表1 不同显色剂用量对吸光值的影响

由表1可以看出，吸光值随着显色剂加入量的增大而增大，在显色剂用量为4 mL的时候，曲线的斜率较大，之后趋于平缓，所以本试验选用显色剂的加入量为4 mL。

2.1.2 稳定剂用量的确定

在检测过程中发现，样品的吸光值会随着时间变化呈下降趋势，可能是由于生成的硫氰酸铁颜色不稳定，因此使用Triton-X-100溶液作为显色稳定剂，而稳定剂的用量对实验结果也有明显的影响，见表2。

表2 不同稳定剂用量对吸光值的影响

由表2可以看出，分别在5，30和60 min测量吸光值，当Triton-X-100溶液加入量为4 mL的时候，吸光值变化最小，越靠近4 mL变化也越小。因此选择稳定剂的加入量为4 mL。

2.1.3 标准曲线的绘制

吸取硫氰酸钠工作液(质量浓度100 mg/L)0，0.25，0.5，0.75，1.0 mL于50 mL的容量瓶中， 加入4 mL硝酸铁溶液，再加入4 mL的Triton-X-100溶液，最后用纯水定容，摇匀。暗处放置2 min，以零号管试剂空白做参比，在465 nm下测定吸光度。以吸光度(Y)对硫氰酸钠浓度(x)得到线性回归方程Y=0.0386x+0.0002,R2=0.9995，标准曲线如图1所示。

2.1.4 检测限、精密度与回收率测量

按上述方法，对空白溶液连续进行11次测量，求出其标准偏差S=0.10，以3倍的标准偏差得出本方法的最低检测限(LOD)为0.3 mg/L。

对质量浓度为1.0 mg/L的标准溶液进行7次重复测量，计算相对标准偏差(RSD)为3.70%。

为了研究检测方法的可靠性，对空白样品进行加标回收实验。称取空白样品各5 g，然后分别加入质量浓度为100 mg/L硫氰酸钠工作液0.75，2.5，5 mL，按上述前处理方法处理，然后进行加标回收实验，回收率可达99.05%～107.5%，实验结果如表3所示。

表3 硫氰酸钠加标回收检测结果

2.2 液相色谱法

2.2.1 流动相的选择

硫氰酸钠在水中电离成硫氰酸根离子，而硫氰酸根是带电的强极性物质。试验初期采用磷酸-三乙胺组成的缓冲液体系[6]，但效果不是很理想，保留时间会发生偏移。后来采用磷酸盐缓冲液(pH=7)，同时采用乙腈作为有机相[7]，取得较好的峰型和系统适应性参数。

2.2.2 色谱柱的选择

对于色谱柱的选择，选用了Agilent Eclipse XDBC18柱和Trigerkin ODS3柱进行比较。硫氰酸根在ODS柱的出峰时间为3.58 min，在C18柱的出峰时间为1.75 min。但采用ODS柱的标准溶液在出峰后会有一个向下的趋势，而C18柱峰型良好，因此选用C18色谱柱，典型奶粉样品图见图2。

2.2.3 标准曲线绘制

精密量取硫氰酸钠储备液，逐级稀释得到质量浓度为100，50，10，5，1 mg/L的硫氰酸钠标准工作液，然后在上述色谱条件下上机测定，每个质量浓度测定3次，记录色谱峰面积均值，以峰面积(A)对标准工作液浓度(C)得到线性回归方程，A=16.153C+1.9812，R2=0.9999。结果表明，该方法进样质量浓度在1～100 mg/L范围内线性良好。质量浓度10 mg/L的标准工作液的色谱图如图3所示。

2.2.4 检测限、精密度与回收率测量

在上述色谱条件下，对空白溶液连续进行11次测量，求出其标准偏差S=0.063，以3倍的标准偏差得出最低检出限(LOD)为0.2 mg/L。

对质量浓度为5 mg/L标准工作液进行7次重复测量，得出相对标准偏差RSD为1.31%。

为了研究方法的可靠性，对空白样品进行加标回收实验。分别在空白样品中添加5 mL质量浓度为3，5，10，50 mg/L的标准工作液，经过前处理后，按上述色谱条件进行检测，回收率达到83%～99.06%，结果如表4所示。

表4 硫氰酸钠加标回收检测结果

2.3 离子色谱法

2.3.1 色谱柱的选择

硫氰酸根是疏水性较强的阴离子，在普通的阴离子柱上保留时间长、易拖尾且会出现峰型不对称的情况，因此需要选择亲水性强的阴离子色谱柱。本研究将IonPac AS16、SH-Anion-1和IonPac AS19阴离子色谱柱进行了比较，发现IonPac AS19对于硫氰酸根分离时间短、峰型对称且分离度高，效果非常理想。

2.3.2 淋洗液浓度的选择

由于硫氰酸根属于疏水性阴离子，因此在色谱柱上保留时间较长，一般情况下需要浓度较高且洗脱能力较强的淋洗液进行淋洗。固定流速对淋洗液的浓度进行考究，发现随着淋洗液浓度的增大，硫氰酸钠保留时间缩短，且峰型拖尾状况得到改善。当设定淋洗液浓度为30 mmol/L的时候，出峰时间约为25 min，当淋洗液浓度增大到50 mmol/L的时候，出峰时间提前到约11 min，且峰型良好，典型奶粉样品图见图4，因此选用50 mmol/L的KOH进行等度淋洗[8]。

2.3.3 标准曲线绘制

将硫氰酸钠储备液逐级稀释得到2，1.5，1，0.5，0.1，0.05 mg/L的硫氰酸钠标准工作液，在上述色谱条件下直接上机测定，每个浓度测定3次，记录色谱峰面积均值，以峰面积(A)对标准工作液质量浓度(ρ)得到线性回归方程，A=0.0615ρ-0.0003，R2=0.9999。 结果表明，该方法进样质量浓度在0.05～2 mg/L范围内线性良好。质量浓度1 mg/L的标准工作液的色谱如图5所示。

2.3.4 测量结果

在上述色谱条件下，将标准溶液进样，以3倍信噪比(S/N=3)计算，得出最低检测限为0.05 mg/L。

对质量浓度0.5 mg/L的标准溶液进行7次重复测量，得出相对标准偏差RSD为0.615%。

同样对空白样品进行加标回收实验。在空白样品中添加5mL质量浓度为1，5，10 mg/L的标准工作液，经过前处理后，按上述色谱条件进行检测，回收率达到81.7%～99.13%，结果如表5所示。

表5 硫氰酸钠加标回收检测结果

2.4 样品检测比较与讨论

采用本文三个方法对市场上不同品牌的6个奶粉样品和6个液奶样品进行检测，每个样品重复三次，取平均值。其测定结果相近且样品加标回收实验结果理想，典型奶粉样品的加标结果如表6所示。

表6 典型奶粉样品加标结果对比

结果表明，紫外分光光度法的检测限为0.3 mg/L，当加标量为0.3 mg/L时，空白回收率可达到102.6%；当加标量为1 mg/L时，空白回收率为107.5%，但样品加标回收率只有95.31%。说明低质量浓度检测时紫外分光光度法对样品结果干扰较大，不适合质量浓度太低的样品检测，而且紫外分光光度法由于在样品分析过程中会出现浑浊情况影响实验结果，所以不适用于液奶的测定，对于奶粉测定结果良好。

液相色谱法的检测限为0.2 mg/L，当加标量为0.3 mg/L时，空白回收率仅为80.33%，当加标量为1 mg/L时，空白回收率达到97.69%，样品加标回收率为102.15%，当加标量为5 mg/L时，空白回收率达到99.06%。

离子色谱法的检测限为0.05 mg/L，当加标量为0.1 mg/L时，空白回收率仅仅只有81.7%，当加标量为1 mg/L时，空白回收率达到99.13%，样品回收率可达到101.1%。液相色谱和离子色谱对于样品检测结果干扰都比较小，而离子色谱更适合于低浓度样品检测。

因此，各个方法都具有良好的适用性和实用性，可以根据不同的需求加以选择。另外，由于环境污染等原因，乳制品中会含有痕量硫氰酸根本底，其含量因品种、个体、环境等因素而存在差异[9]。因此，选用有品牌保证的乳制品将降低硫氰酸钠摄入污染的风险。

3 结 论

本文建立了奶粉和牛奶中硫氰酸钠的分析检测方法，重点比较了分光光度法、液相色谱法和离子色谱法对于检测乳品中硫氰酸钠的检测限、精密度以及回收率。

结果表明，低质量浓度的回收率要低一些，因此对硫氰酸钠的分析结果相对误差要大一些。紫外分光光度法仅适合奶粉的检测，但不适合低浓度奶粉样品的检测，相对来说误差要大。而液相色谱和离子色谱对于样品检测干扰较小，且离子色谱对于低浓度的样品检测结果更加可靠。

因此，对于一些资金少、仪器操作人员不够专业的小型奶粉企业可以采用紫外分光光度法，此设备价格合理，而且操作简单、实验时间短，很适合在各奶粉制品企业推广；液相色谱法检测限低，应用范围广泛，适用于实验室以及检测单位；离子色谱法检测限更低，仪器更加灵敏，但设备也比较昂贵，推广范围不是很广，因此主要适用于各个研究院以及检测单位的微量物质检测。

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