婴幼儿配方奶粉中维生素B2的快速测定

2013-07-13官咏仪林海丹邹志飞陈毓芳金梦李小丽秦燕

中国乳品工业 2013年2期

官咏仪，林海丹，邹志飞，陈毓芳，金梦，李小丽，秦燕

(广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广州510623)

0 引言

维生素B2(核黄素)是体内多种氧化酶系统不可缺少的辅酶，是维持人体正常物质代谢和某些特殊生理功能不可缺少的低分子有机化合物。但其和其他的B族的维生素一样，需以食物或营养补品来补充，婴幼儿配方食品中添加量应以维持能量代谢平衡为基础，因此，测定其质量分数显得尤为重要。

目前，维生素B2检测方法常用的有高效液相色谱法、荧光分光光度计法[1,2]、液相色谱-串联质谱法[3]等。国家标准方法[4]为高效液相色谱法，其测定步骤繁琐，测定的维生素B2包括游离态和结合态的维生素B2，但婴幼儿配方奶粉中的维生素B2主要以游离态形式存，因此本文对乳粉中维生素B2的快速测定进行研究，筛选了沉淀蛋白和去除脂肪的方法，建立了简便、有效可行的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

维生素B2标准品(纯度 99%,)；甲醇(色谱纯)；偏磷酸、盐酸(分析纯)；超纯水(由Mill-Q纯水器系统制得)。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪 (配有岛津LC 20AD泵，SIL 20AC自动进样器，RF10AXL荧光检测器，LC solution色谱工作站)；超声波水浴；水平往复振荡器；高速冷冻离心机；涡旋振荡器。

1.3 标准工作液的配制

称取25 mg(精确至0.1 mg)维生素B2标准品，加入盐酸:水(1∶1，体积比)2 mL，超声溶解后，用超纯水定容至100 mL配成标准贮备液，质量浓度为250 mg/L，置于4℃冰箱避光保存，保存期为3个月。临用前用超纯水将标准贮备液逐级稀释得到质量浓度为0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，3.00 mg/L的系列标准工作溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-H2O(33∶67,体积比)；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为10 μL；激发波长为462 nm，发射波长为522 nm。

1.5 样品处理

称取2 g(精确至0.01 g)试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入3%偏磷酸水溶液溶解并定容至50 mL，涡旋混匀1 min，置水平往复振荡器上振荡或超声波水浴中超声提取10 min(避光)，取出加入5 mL正己烷涡旋混匀1 min，转速以不低于4 000 r/min离心5 min，下层水相经0.45 μm水相滤膜过滤后，供液相色谱测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相得选择

实验常用的甲醇-水作为流动相。结果表明，甲醇-H2O(33∶67,体积比)，在此色谱条件下，标准品峰形好，样品在出峰时间无干扰峰。维生素B2标准和样品的色谱结果如图1和图2所示。

2.2 提取溶液的选择

维生素B2微溶于水，在强酸溶液中稳定。奶粉为高蛋白的样品，实验考虑采用酸性水相提取，还需兼顾去除蛋白、脂肪等杂质干扰。对1%盐酸、亚铁氰化钾和硫酸锌溶液和3%偏磷酸作为沉淀剂进行实验，实验表明沉淀效果以3%偏磷酸最佳，1%盐酸不能完全沉淀蛋白质，亚铁氰化钾和硫酸锌溶液为沉淀剂时回收率差。原因可能是维生素B2为6,7-

二甲基异咯嗪与核醇的缩合物，在N1和N10原子上具有两个活泼的双键，易发生氧化还原反应[5]，因此不宜用亚铁氰化钾作沉淀剂。常见的偏磷酸有三偏磷酸和四偏磷酸，其水溶液pH值约为2，并含有、两种离子，分别带4和5个单位的负电荷。在酸性的偏磷酸水溶液中，蛋白质所带的正电荷被偏磷酸水溶液中的负电荷中和，同时偏磷酸溶液中的含氧酸根与水形成了稳定的水合离子，夺取了蛋白质胶粒表面上所持有的溶剂化水，破坏了胶粒的水化膜，胶粒完全失去了保护作用，随即凝结沉淀[6]。蛋白质中所含的不同蛋白有不同的等电点，质量分数为1%的盐酸不能达到全部蛋白的等电点，且盐酸为一元强酸，所带负电荷数量较偏磷酸少，与蛋白质所带正电荷的中和反应速率较慢，因此未能快速完全的沉淀奶粉中的蛋白质。因此本实验最后采用3%偏磷酸作为提取溶剂。