ZD6474衍生物筛选和抗肿瘤活性研究

周祥，于冰，侯文彬，徐春秀，石玉，李祎亮



ZD6474衍生物筛选和抗肿瘤活性研究

周祥，于冰，侯文彬，徐春秀，石玉，李祎亮

530001 南宁，广西中医药大学研究生院（周祥）；300193 天津药物研究院天津市新药安全评价中心（于冰），中药现代研究部（侯文彬），天津市新药设计与药物发现重点实验室（石玉、李祎亮）；300193 天津中医药大学研究生院（徐春秀）

对自主研发的 ZD6474 衍生物进行抗肿瘤活性研究，从而为进一步的结构修饰、改造与药理学研究奠定良好的基础。

采用均相时间分辨荧光法以 VEGFR-2、EGFR 为检测靶点评价化合物的抑制活性；采用 SRB 法检测化合物对细胞的增殖抑制活性；移植人非小细胞肺癌 H1299 裸鼠模型作为体内抗肿瘤活性评价。

从大量化合物中筛选出 4 个有较好酪氨酸激酶抑制活性的化合物，分别编号为106、113、115、116。体外细胞实验结果显示化合物对肿瘤细胞生长增殖均有抑制作用，其中 106 对A431、H1975 和 A549 细胞系均表现出良好的抑制活性。体内试验结果表明，106 能够剂量依赖性抑制裸鼠肿瘤生长，且作用与 ZD6474 相当，25、75 mg/kg 的106 和 ZD6474 对 H1299 的相对肿瘤增殖率为 57.3%、38.8% 和 52.5%、29.6%。

化合物106 具有良好的体内外抗肿瘤作用，有进一步的研究价值。

蛋白酪氨酸激酶类； 药物筛选试验，抗肿瘤； 癌，非小细胞肺； 凡德他尼

蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTKs）是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，它们在细胞内的信号转导通路中占据了十分重要的地位，调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理生化过程。研究表明，超过 50% 的原癌基因和癌基因产物与蛋白酪氨酸激酶活性相关，其异常表达会引起细胞内多种信号通路，如与细胞增殖和分化相关的促分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路以及抵抗细胞凋亡的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路等出现传导异常，造成细胞增殖紊乱，最终导致肿瘤发生[1-2]。因此通过阻断酪氨酸激酶可破坏肿瘤细胞的信号传递，可以达到抗肿瘤的目的[3]。

ZD6474（凡德他尼）属于新一代喹唑啉类化合物，对 VEGFR-2、EGFR 等酪氨酸激酶具有显著抑制作用[4]。在肿瘤的临床治疗中，ZD6474 对非小细胞肺癌、甲状腺癌等具有显著的临床治疗效果，但III期临床试验中，表现出了较多的毒副作用[5]。本课题组在 ZD6474 的研究基础上合成一系列的新化合物，对这些化合物进行体外活性筛选和抗肿瘤活性研究，以期找到高效、低毒、具有开发前景的自主抗肿瘤新药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 生物素标记的蛋白酪氨酸激酶多肽底物（poly-Glu-Ala-Tyr）、链激酶素标记的 XL-665（一种经改良的别藻蓝蛋白）、结合生物素标记的抗磷酸化酪氨酸抗体的铕联穴状化合物（EuK）购自法国 Cisbio Bioassay 公司；ATP 和 HEPES 购自美国 Amresco 公司；EGFR 和 VEGFR-2 激酶购自美国 BPS Bioscience 公司；A431、H1975 和 A549 细胞购自北京协和医学院细胞中心，本实验室冻存使用；DMEM 培养基、RPMI-1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国 Gibco 公司。

1.1.2 动物及瘤株 SPF 级裸鼠 25 只，体重18 ~ 22 g，合格证号：SCXK（沪）2007-0005，由无锡江原安迪科公司提供；H1299 细胞瘤亦由该公司提供。

1.1.3 受试化合物 ZD6474、106、113、115、116 等均由本实验室合成，以 DMSO 配置成10 mmol/L 的溶液备用。

1.2 方法

1.2.1 EGFR 和 VEGFR-2 激酶抑制活性筛选 根据均相时间分辨荧光法（HTRF）以 VEGFR-2、EGFR 为检测靶点对化合物进行筛选。配制 10 μmol/L ATP、200 nmol/L TK Substrate-biotin 的工作液，按体积比例 ATP:TK Substrate-biotin: Kinase buffer = 2:2:2 取液混匀；药物用 Kinase buffer 稀释为所需浓度；配制 0.25 ng/μl EGFR 和 2 ng/μl VEGFR-2的酶工作液。以白色 384 孔板为实验容器，每孔加入 6 μl 混匀液、2 μl 药物、2 μl 激酶、混匀，置 37 ℃温育反应30 min。然后，依次加入 5 μl 链激酶素标记的 XL-665 及 5 μl 结合了 Eu3+的穴状化合物抗体，混匀。室温放置 30 min 后于酶标仪 314 nm 激发，检测 665 nm 和 620 nm 荧光。反应设 3 复孔，设阴性对照及空白对照。按以下公式计算激酶抑制率：抑制率（%）=[（Ratio665/620对照孔－Ratio665/620给药孔）/ Ratio665/620对照孔]× 100%

以抑制率为纵坐标，log[M] 为横坐标（M 为浓度），采用 Graphpad prism 5.0 软件拟合曲线，计算 IC50值。

1.2.2 SRB 法检测肿瘤细胞的增殖抑制活性 取对数生长期的待检测细胞接种于 96 孔培养板（细胞浓度为 8000 个/孔），37 ℃、5% CO2条件下常规培养 24 h。待细胞经 24 h 贴壁后，每孔加入20 μl 配置好的不同浓度的药液。经过 48 h 培养后，各孔中加入 4 ℃、50 % 的 TCA 50 μl，于 4 ℃孵育 1 h。取出培养板，轻轻倾去板内液体，用蒸馏水轻轻冲洗 5 遍，置于空气中风干至不见水痕。然后每孔加入配制好的 0.4% SRB 50 μl，于室温下静置染色 20 min 后，倾去 SRB 溶液，用 1% 乙酸冲洗 5 遍，以除去未与蛋白质结合的染料。置于空气中风干至无水痕后，每孔加入 Tris 缓冲液（10 mmol/L）150 μl，将染料溶解后，于振荡器上振荡 5 min，560 nm 波长读取各孔值。反应设 3 复孔，设无药对照组和空白组。按以下公式计算激酶抑制率：

以抑制率为纵坐标，log[M] 为横坐标（M 为浓度），采用 Graphpad prism 5.0 软件拟合曲线，计算 IC50值。

1.2.3 化合物106 的体内抗肿瘤作用 取 H1299 肺癌裸鼠（瘤株），无菌条件下取局部生长良好的肿瘤组织。然后将肿瘤组织与生理盐水按 1:20 的比例混合匀浆，制备成约 1 × 107PBS 细胞悬液（显微镜下观察），皮下种植于 6 周大的裸鼠腹侧，每只约注射 0.2 ml。待体积增长到 100 ~150 mm3时进行试验。按公式：肿瘤体积= 长径 × 短径/2 × 0.5 计算肿瘤的体积。动物按肿瘤大小随机分组，即阴性对照组和 106 及 ZD6474 的高低剂量组。给药剂量为 25 和 75 mg/kg，口服灌胃，每天给药 1 次，连续 2 周。从第 1 天开始，每3 天测一次肿瘤体积，称鼠重。相对肿瘤体积RTV = Vt/V0，Vt为每次测量时的肿瘤体积，V0为开始给药时的肿瘤体积。根据 RTV 计算肿瘤增殖速率：

肿瘤增殖速率（%）= 给药组的 RTV 均值/对照组的RTV 均值 × 100%

1.3 评价标准[6]及统计学处理

2 结果

2.1 EGFR 和 VEGFR-2 激酶抑制活性筛选

实验中多肽底物对化合物表现为浓度依赖性抑制作用，多肽底物的磷酸化水平随着化合物浓度增高而降低。对本实验室的大量自主研发的 ZD6474 衍生物进行筛选，得出 4 个活性化合物。它们对 VEGFR-2 激酶抑制活性与 ZD6474 相当，但对 EGFR 激酶的抑制活性要高于 ZD6474，其 IC50值见表 1。

表 1 化合物对受试激酶抑制作用

2.2 肿瘤细胞的增殖抑制活性

结果表明，这些化合物均能不同程度地抑制 A431、H1975 和 A549 细胞（表 2）。其中 106 对 3 种肿瘤细胞的 IC50最低，分别为 0.77、3.06 和 5.66 μmol/L，且对 A431 和 H1975 细胞的增殖抑制作用优于阳性药物 ZD6474 和厄洛替尼。

表 2 化合物对肿瘤细胞增殖抑制作用

2.3 化合物 106 的体内抗肿瘤作用

根据体外药效筛选结果，选取化合物 106 进行体内抗肿瘤作用，并与对照 ZD6474 进行比较。结果显示：两种剂量的 106 和 ZD6474 均能抑制肺癌 H1299 的生长，且呈剂量依赖性，肿瘤增殖速率分别为57.3%、38.8%；52.5%、29.6%（表 3）。根据疗效评价标准 25 mg/kg 的 106 和 ZD6474 对裸鼠 H1299 肺癌有疗效，疗效相当；75 mg/kg的106 和 ZD6474 对裸鼠 H1299 肺癌有疗效，106 疗效略低于 ZD6474。给药后 ZD6474 组均出现死亡，高剂量体重下降明显，与对照组比较有显著性差异（< 0.01），对裸鼠的副作用明显高于 106（图 1 ~ 2）。

3 讨论

本实验采用均相时间分辨荧光法和 SRB 法对化合物进行体外酶活性筛选和细胞抑制活性研究。激酶抑制筛选实验选出 4 个化合物 106、113、115、116 对 EGFR 和 VEGFR-2 靶点都具有较好的活性，其中 EGFR 抑制活性要优于阳性对照 ZD6474。因此选用 EGFR 高表达人表皮鳞状细胞癌 A431 细胞株及非 EGFR 高表达细胞人肺腺癌 A549 细胞株进行肿瘤细胞的增殖抑制活性实验。结果显示 106、113、115 对 A431 细胞和 A549细胞均有增殖抑制作用，且对高表达细胞 A431 的抑制活性要高于 A549，可以初步认为这些化合物对 EGFR 靶点有很好的抑制作用。目前批准用于肺癌的靶向药物厄洛替尼在 EGFR 激活突变的患者中已经取得很好疗效，然而 T790M 继发耐药性突变被认为是导致获得性耐药的主要原因，这部分患者不能够从 EGFR TKIs（EGFR 酪氨酸激酶抑制剂）中获益[7]。本实验应用 EGFR TKIs 耐药的 EGFR（T790M）突变的人非小细胞肺腺癌 H1975 细胞株检测化合物抑制活性，结果显示，与厄洛替尼对照，106、115、116 和 ZD6474 对 H1975 细胞有增殖抑制作用，且 106 的作用要强于 ZD6474，提示 106 可能成为治疗继发耐药的非小细胞肺癌的药物。

表 3 106 和ZD6474 对人肺癌H1299 裸小鼠移植瘤的疗效

注：d0：分笼给药时间；d21：给药后21 d。*：与对照组比较，< 0.05；**：与对照组比较，< 0.01。

Notes: d0: Time of administration; d21: After the treatment the 21st day.*: Compared with control group,< 0.05;**: Compared with control group,< 0.01.

图 1 给药期间人肺癌 H1299 裸小鼠移植瘤的相对肿瘤体积变化情况（）

图 2 给药期间 H1299 裸小鼠体重变化情况（）

肺癌为目前世界范围的高发肿瘤之一，其中非小细胞肺癌所占比例高达约 80%[8]。本试验所用 NCI-H1299 细胞是肺鳞癌细胞，为典型的非小细胞肺癌。该细胞株与 A549 细胞株相比对 EGFR TKIs（如吉非替尼）更为耐药[9]。我们以此天然人肺癌耐药细胞株为研究对象，观察化合物 106 对该肿瘤的体内疗效。根据疗效评价标准，25 和75 mg/kg 剂量 106 的肿瘤增殖速率均小于 60%，与对照组相比有显著性差异，说明 106 对 H1299 人肺癌有疗效，呈剂量依赖性。实验中相同剂量时，106 对肿瘤的增殖速率略高于 ZD6474，表明 106 对该肿瘤疗效略低于 ZD6474；但是 ZD6474 给药组出现裸鼠死亡现象，高剂量裸鼠体重持续下降，副作用明显，因此 106 仍具有开发前景。106 对非小细胞肺癌表现出了良好疗效，具体的作用机制我们还需要进一步研究。

本实验结果表明化合物 106 具有良好潜力成为小分子酪氨酸激酶靶向抗肿瘤药物，可以以此为研究方向进行结构修饰、改造与药理学研究。

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Screening and anti-tumor activity study of ZD6474 derivatives

ZHOU Xiang, YU Bing, HOU Wen-bin, XU Chun-xiu, SHI Yu, LI Yi-liang

Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, China (ZHOU Xiang); Tianjin Centre for Drug Safety Evaluatian and Research (YU Bing), Modern Research Department of Traditional Chinese Medicine (HOU Wen-bin), Tianjin Key Laboratory of Molecular Drug & Drug Discovery (SHI Yu, LI Yi-liang), Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China; Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China (XU Chun-xiu)

To study the anti-tumor activity of new ZD6474 derivatives for further structural modification, renovation and pharmacological studies.

Homogeneous time-resolved fluorescence method (HTRF) was used to evaluate the compounds’ inhibitory activity against VEGFR-2 and EGFR. Cell proliferation inhibition activity of the compounds was tested by SRB assay. Nude mice xenograft model of human NSCLC H1299 cells was used to test the compounds’ anti-tumor activity in vivo.

Four compounds, numbered as 106, 113, 115, 116, showed preferably tyrosine kinase inhibitory activity from the screening. The compounds can inhibit tumor cell growth, among which No.106 compound showed most potent inhibitory activity in A431, H1975 and A549 cell lines. Moreover, No.106 compound dose-dependently inhibited tumor growth in vivo, showing comparable effects with that of ZD6474. When administered at dose of 25 and 75 mg/kg, the H1299 tumor inhibition rate was 57.3% and 38.8% for No.106 compound, and was 52.5% and 29.6% for ZD6474, respectively.

The No.106 compound has potent anti-tumor activity both in vitro and in vivo, and is worthy of further research.

Protein-tyrosine kinases; Drug screening assays, antitumor; Carcinoma, non-small-cell lung; Vandetanib

李祎亮，Email：langyil@sina.com

2013-01-04

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.006

LI Yi-liang, Email: langyil@sina.com