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评价自身抗体联合检测在诊断自身免疫性疾病中的应用

2013-07-10孙善会张茂修

中国医药指南 2013年36期
关键词:均质细胞核核型

孙善会 郑 燕* 张茂修

(山东大学附属济南市中心医院医学实验诊断中心,山东 济南 250013)

评价自身抗体联合检测在诊断自身免疫性疾病中的应用

孙善会 郑 燕* 张茂修

(山东大学附属济南市中心医院医学实验诊断中心,山东 济南 250013)

目的 探讨检测抗核抗体(ANA)核型与抗可提取性核抗原(ENA)抗体及抗双链DNA(ds-DNA)抗体之间的相关性,提高对自身免疫性疾病(AID)的诊断及鉴别诊断参考价值。方法 资料来源门诊及住院的AID病例血清标本进行检测,ANA检测采用间接免疫荧光法(IIF),抗ENA抗体检测采用欧蒙斑点法(抗nRNP/Sm、Sm、SSA/Ro、SSB/Lo、Scl-70和Jo-1)六项抗体及抗(ds-DNA)抗体采用ELISA法检测。结果 在98例ANA阳性病例血清标本中核型分布为:细胞核均质型(36.74%),细胞核颗粒型(41.84%),细胞核仁型(11.22%),细胞核膜型(1.02%),细胞核着丝点型(1.02%);重叠核型中细胞核均质型/细胞核颗粒型(2.04%),细胞核均质型/细胞浆颗粒型(6.12%)等。98例ANA与ENA同时阳性血清标本中42例抗双链DNA抗体阳性(42.86%)。36例均质型阳性样本中抗SSA/Ro抗体(24.48%),抗SSB/Lo抗体(6.12%),抗nRNP/Sm抗体(6.12%)。41例细胞核颗粒型阳性样本抗nRNP/Sm抗体(19.39%),SSA/Ro抗体(15.31%),抗SSB/Lo抗体(6.12%)。ANA阳性可出现一种或多种自身抗体。结论 ANA常见核型有:细胞核颗粒型,细胞核均质型及细胞核仁型。ANA均质型核型检出的抗ds-DNA抗体为主,且抗ds-DNA抗体含量与荧光强度成正比。ANA核型与抗ENA抗体二者之间有一定的相对应性。ANA及核型、抗ENA抗体和抗ds-DNA抗体的联合检测可明确诊断AID,而且利于判断患者血清中各种自身抗体与临床表现的关系。

抗核抗体;抗ENA抗体;抗双链DNA抗体;间接免疫荧光法;细胞核型

ANA主要用于AID的筛查。ANA所针对的靶抗原包括细胞的全部成分。随着对特异性抗体的认识,从只检测总抗体逐步过渡到针对抗原蛋白分子表位靶位点的特异性抗体检测。AID血清中可检测出多种特异自身抗体,目前临床多以ANA、抗ENA抗体和抗抗ds-DNA抗体联合检测应用较多的项目,抗ENA抗体又称盐水可提取性核抗原抗体属于抗核抗体,ENA是细胞内许多小分子的RNA和多肽组成的非组蛋白的酸性核蛋白颗粒,主要有六种:抗nRNP抗体(抗核内的核糖核蛋白抗体)、抗Sm抗体(核内小核糖体蛋白抗体)、抗SSA/Ro抗体、抗SS-B/La抗体、抗Scl-70抗体、抗Jo-1抗体。抗dsDNA抗体又称抗脱氧核糖核酸抗体,其反应座位点位于DNA脱氧核糖磷酸框架上。本组病例对2008年10月至2009年12月在本院门诊和住院病例ANA阳性样本的测试结果在AID疾病中进行分析,探讨ANA特异性荧光模式与抗ENA抗体及抗ds-DNA抗体之间的相对应性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2008年10月至2009年12月我院门诊及住院病例。AID患者ANA阳性98例,其中男性6例,女性92例,年龄15~83岁,平均年龄48.40岁。

1.2 试剂与步骤

1.2.1 ANA检测

ANA间接免疫荧光法(IIF),德国欧蒙公司试剂。实验严格试剂操作说明书,血清稀释1∶100后,取25μL血清与包被HEp-2细胞及大鼠肝组织生物载片室温(18~25℃)反应30min。磷酸盐吐温缓冲液冲洗反应板,缓冲液再浸泡5 min。加FITC标记的羊抗人球蛋白(荧光二抗)20μL。室温育30min,再同上法磷酸盐吐温缓冲液洗涤浸泡,甘油封片后荧光显微镜下观察Hep-2细胞和大鼠肝组织,此时荧光素标记的抗人抗体与结合在生物基质上的抗体反应,形成在荧光显微镜下观察到的特异性的荧光模型。特异性染色荧光在Hep-2及大鼠肝细胞中显现为阳性。无荧光可判断为阴性,阳性病例根据着色位置判断反应区荧光染色核型。

表2 98例ANA阳性病例中抗ds-DNA抗体阳性分布

表3 98例ANA与抗ENA抗体阳性病例分布

表4 抗ds-DNA抗体阳性与抗ENA抗体阳性病例分布

1.2.2 抗ENA抗体测定

德国欧蒙公司试剂。根据试剂盒操作说明进行实验,该欧蒙斑点法检测六种人抗nRNP/Sm.Sm、SSA/Ro、SSB/Ro、Scl-70和Jo-1特异抗体的体外定性检测,载片上2条实验膜条上平行包被了经亲和层析纯化的六种抗原。第一次温育将患者标本血清1∶100稀释后的稀释血清50μL加入反应板中与膜条上的抗原结合反应,血清中特异性的IgG抗体可与相应抗原反应结合。为充分结合反应在300rpm旋转摇床上室温温育30min。缓冲液冲洗后反应板后加入碱性磷酸酶酶标抗人IgG进行下一步放置温育30min,再一次冲洗后加入显色底物液以产生反应显色。可观察到包被各抗原条带着色变化,反应显色者为阳性。比对固定包被显色位置,对特异抗体阳性做出判断。

1.2.3 抗ds-DNA抗体检测

采用爱尔兰Trinity Biotech公司试剂的ELISA法。执行操作规程。1∶20倍血清稀释后。每个微孔中加入100μL稀释的血清标本和标准品,室温30min,然后每反应空中加入300μL缓冲液洗涤5次,第二步加入酶标二抗100μL。室温反应30min,再缓冲液洗涤5次。加入显色底物液100μL,反应时间10min后混入终止液100μL,规定时间内酶标仪含(450nm吸光度值)测定。结果判定:比值是标本OD值/(标准液平均OD值×校正因子),阴性值≤0.9,阳性值≥1.1,可疑值0.91~1.09。

1.3 仪器

荧光显微镜观察ANA 荧光模型Olympus BX60型显微镜,激发滤片:488nm,分光滤片510nm,阻挡滤片520nm。光源:100W汞灯。酶标仪(美国Bio.Rad公司)在波长450nm处测吸光度值。

2 结 果

2.1 98例ANA阳性病例血清中,细胞核型分布见表1。ANA核型细胞核颗粒型(41例,41.84%),ANA核型细胞核均质型(36例,36.74%),ANA核型细胞核仁型(11例,11.22%),ANA核型细胞核膜型(1例,1.02%),ANA核型细胞核着丝点型(1例,1.02%),细胞核均质型重叠细胞核颗粒型(2例,2.04%) ,细胞核均质型重叠细胞浆颗粒型(6例,6.12%)等。唯一细胞核型可出现,亦有两种或两种以上核型重叠同一病例中。常见ANA核型阳性率最多的为核颗粒型,其次为均质型和核仁型。

表1 98例ANA阳性核型分布

2.2 98例ANA阳性病例血清中ds-DNA抗体阳性分布见表2。42例抗ds-DNA抗体阳性(42/98,42.86%)。该组ANA、抗dsDNA抗体同时阳性样本中均质型(21/42,50%),细胞核颗粒型(20/42,47.62%)。

2.3 98例ANA与抗ENA抗体均阳性见表3。抗ENA抗体中抗SS-A/Ro抗体(54例,55.11%),抗SS-B/La抗体(16例,16.32%),抗nRNP/ Sm抗体(27例,27.55%),抗Scl-70抗体(1例,1.02%),抗Jo-1抗体(0例)。ANA核颗粒核型,抗nRNP/Sm抗体检出率最高。

2.4 表4中抗ds-DNA抗体与抗ENA抗体分布分析。ds-DNA阳性时,抗ENA抗体可唯一出现或两种以上特异自身抗体出现,抗SSA/Ro阳性率最高。

3 讨 论

AID筛查首选是ANA检测,而IIF检测ANA是经典方法,可检测到整个细胞荧光染色模型,即ANA自身抗体的核型,这对AID的诊断不可或缺[1]ANA从抗细胞核抗原成分的自身抗体的检测,扩展为检测整个细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期等成分[2]。IIF的ANA检测优势是检测到广义的ANA,卫生部临检中心核型分为:细胞核均质型、细胞核颗粒型、细胞核核仁型、细胞核核膜型、细胞核着丝点型、细胞浆胞浆颗粒型及细胞浆胞浆纤维型等核型。试剂选择通过2种抗原基质HEp-2细胞和大鼠肝组织的特异染色分布的观察,更能准确分析以上多种核型。ENA是可提取性核抗原的总称,是细胞核和细胞浆中抗小分子核糖核蛋白的自身抗体,分子中不含DNA,该组成使其各自的抗原性得以增强。抗DNA抗体中抗dsDNA抗体。又称抗脱氧核糖核酸抗体。

98例ANA阳性血清标本中,常见核型有细胞核颗粒型41/98(41.84%)、细胞核均质型36/98(36.74%)和细胞核仁型11/98(11.22%)。98例ANA与抗ENA抗体同时阳性血清标本中,抗ds-DNA阳性率为42例42.86%。在42例抗ds-DNA阳性血清中,细胞核均质型21/42(50%),细胞核颗粒型20/42(47.62%),细胞核模型1/42(2.38%)。抗ds-DNA抗体,主要和核型是均质性和核颗粒型,少有细胞核模型。

98例ANA阳性血清标本中,54例抗SS-A抗体阳性,细胞核均质型24(24.49%),细胞核颗粒型15(15.31%),细胞核仁型10(10.21%),54例抗SS-A抗体阳性中抗ds-DNA抗体阳性27例,SS-A抗体阳性可一种或一种以上多核型重叠出现,与抗ds-DNA等多种抗体存在相关.国内外报道,AID中是一种以免疫调节异常为特征的自身免疫性疾病,例如系统性红斑狼疮(SLE),个体血清中可出现一种或多种自身抗体ANA核型[3]。抗ds-DNA抗体是SLE特异标志抗体阳性率(40%~90%)均质型的高滴度的ANA标本可高频率检出抗ds-DNA抗体 ,抗ds-DNA抗体含量与ANA荧光强度成正比[4]。抗EN抗体中Sm抗体也是SLE的标记抗体,ANA核型主要细胞核颗粒型荧光核型(19例,19.39%)。检测发现,ANA包被基质荧光染色膜型与抗ENA抗体及抗ds-DNA抗体之间有相对应性,不同的特异抗体也可以显现类同的荧光染色模型,而同一特异抗体可以在不同血清标本中显现不同荧光染色模型。ANA荧光染色模型与特异性抗体有一定的相对应性,但没有绝对的规律可循,但荧光核型可全面评估参考,对进一步特异性自身抗体检测提供重要参考[5]。ANA核型荧光核型尤其对发现罕见特异抗体提供信息,本组病例收集检测得到的抗Scl-70抗体、抗Jo-1抗体在就诊人群中的阳性率低与样本收集局限有关。

ANA检测及核型分析,可针对性地选择相关的特异抗体测定,避免了盲目地重复检测。无症状人群中也有自身抗体阳性,这可能正如Nielen和Arbuckle等认为的自身抗体阳性的出现远远早于(甚至提前10年)临床症状的出现和发病[6,7]。协同ANA、抗ENA抗体和抗ds-DNA抗体的检测不仅对AID的诊断具有较高敏感性和特异性,并与临床表现结合诊断,及早治疗及预后提供有效信息。

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Association among ANA Patterns, Anti-ENA Antibody and Anti-dsDNA Antibody in Autoimmune Disease

SUN Shan-hui, ZHENG Yan, ZHANG Mao-xiu
(Medical Research and Laboratory Diagnostic Center, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China)

Objective To investigate the association among ANA patterns, anti-ENA antibody and anti-dsDNA antibodies in autoimmune diseases, and the reference significance of detecting these antibodies on the diagnosis and differential diagnosis of autoimmune diseases. Methods Serum samples from 98 pateints with autoimmune disorder were collected. ANA, anti-ENA and anti-dsDNA antibodies were detected using IIF, immuno-dot assay and ELISA. Results The distribution of different ANA nuclear types in the 98 samples was: pattern homogeneous (36.74%); pattern nucleoplasm granular (41.84%); pattern nucleolar (11.22%); pattern nuclear membrane (1.02%); pattern centromere (1.02%); pattern homogeneous/nucleoplasm granular (2.04%)and pattern homogeneous/cytoplasm granular (6.12%). These patterns may occur separately, also could appear at the same sample. Among these 98 samples with both ANA and anti-ENA positive, 42 cases were anti-dsDNA antibodies positive (42.86%). In the 36 patients with ANA-homogeneous, 24 cases were anti-SSA /Ro antibody positive, 6 cases were anti-SSB/La antibody positive, and 6 cases were nRNP/Sm antibody positive. While in the 41 ANA-nucleoplasm granular samples, the positive rates of SSARo, SSB/La and nRNP/Sm antibodies were 15.31%, 6.12% and 19.39%. One or several kinds of ENA antibodies could appear in patients with positive ANA and anti-dsDNA antibodies. Conclusion The familiar nuclear types of ANA include pattern nucleoplasm granular, pattern homogeneous and pattern nucleolar. They occur individually or concurrently, which was correlated with the appearance of anti-ENA and antidsDNA antibodies. Combined detection of ANA, ENA and dsDNA antibodies has higher specificity, sensibility and accuracy in the diagnosis of autoimmune diseases, and is better in describing the correlation of the auto-antibodies appeared in patients and his clinical manifestation, thus provide valuable reference index to the diagnosis, differential diagnosis and therapy of AID.

Antinuclear antibody; Anti-ENA antibodies; Anti-double stranded DNA antibodies; Indirect immunofluorescence; Nucleus type

R446;R593.2

B

1671-8194(2013)36-0020-03

*通讯作者:E-mail:cnfu@sina.com

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