正交法优法牛蒡茎总黄酮提取工艺的研究

田代学 杨 婷 吴 娟 杨 兰 武 芸

【摘 要】利用正交试验方法对牛蒡茎总黄酮的提取工艺进行研究。在单因素试验基础上选取乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度4个因素3个水平进行正交试验，以总黄酮的得率为考察指标，探讨这4个因素对黄酮提取率的影响。结果表明：较优的工艺提取参数为：乙醇浓度60%，液料比1：15，提取时间120min，提取温度60℃。

【关键词】牛蒡；总黄酮；单因素试验；正交试验

牛蒡（Arctium lappal）又名白肌人参，为中国古老的药食两用食物蔬菜[1]。牛蒡可每日食用而无任何副作用，对体内各系统的平衡具有复原功能，且含有黄酮类化合物（Flaonoids），黄酮类化合物有抗菌、抗衰老、降低血糖等作用。目前对牛蒡的研究大多集中于牛蒡子和牛蒡叶的化学成分和药理活性上，关于牛蒡茎化学成分的研究较少报道[2]。就目前牛蒡的开发现状来看，其开发也主要集中在食用价值方面，而对其活性成分和药理性质的研究不够，资源浪费严重。牛蒡是我国传统中药，其主要的药用部分是牛蒡子（牛蒡的瘦果），具有祛风热、消肿痛的作用[3]。本研究采用索氏提取法，对牛蒡茎总黄酮提取工艺条件进行优化，确定其最佳提取工艺，旨在为牛蒡的综合开发和解决资源浪费问题提供技术支撑，以实现资源的最大化利用。

1.试验材料、试剂和仪器

1.1材料与试剂

洗净的牛蒡茎，烘干粉碎备用。

试剂：芦丁标准溶液，无水乙醇，氢氧化钠，硝酸铝，亚硝酸钠（以上均为分析纯），实验所用水均为蒸馏水，实验中所需溶液均现配。

仪器：电热恒温水浴锅，电子天平，紫外分光光度计，索氏提取器，量筒（50mL、10mL），移液管，10mL小试管，圆底烧瓶，比色管，容量瓶。

1.2 试验方法

1.2.1原料的预处理

牛蒡茎→除杂→水洗→烘干→粉碎

1.2.2总黄酮的含量测定

利用黄酮类化合物中的3-羟基、4-羟基、5-羟基、4-羰基或邻二位酚羟基，与铝离子进行络合反应.在碱性条件下生成红色络合物的原理测定其含量。

1.2.3 芦丁标准曲线的绘制

精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL于6支10.00mL的小试管中，用质量分数为60%的乙醇稀释到4.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.30mL，混匀，放置10min，加入10%硝酸铝溶液0.30mL ， 混匀，放置10min，再加入4%的氢氧化钠溶液4.00mL， 混匀，放置10min，加入60%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度，（以第一瓶为空白溶液）以吸光度Y为纵坐标，芦丁标准溶液的质量浓度X（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到芦丁浓度（C）与吸光度（A）关系式：Y=7.0553X+0.0017，R2=0.9984

1.2.4 单因素试验

分别以乙醇浓度（50%、55%、60% 65%、70%）、提取时间（1 h、1.5 h、2h、2.5h、3 h）、提取温度（40℃、50℃ 、60℃ 、70℃、80℃）以及料液比（1：5、1：10、1：15、1：20、1：25）为单因素进行试验，考察各单因素对浸提液中总黄酮得率的影响。

1.2.5正交试验设计

本实验选取提取温度、料液比、浸提时间和乙醇浓度这四个对牛蒡黄酮提取率影响显著的因素，进行4因素3水平正交试验。正交试验设计因素的水平如表1所示。

2.结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1乙醇浓度对牛蒡茎总黄酮提取率的影响

由结果（见表2）可知，随乙醇浓度的增加，黄酮提取率增大，当浓度达到60%时提取率最大；但乙醇浓度继续增加，提取率则明显下降，当浓度达到70%时提取率最小，故宜选用60%乙醇为提取溶剂。

2.1.2提取时间对黄酮提取率的影响

用60%的乙醇，在60℃，液料比1：20的条件下提取。由表3可知，随着提取时间的延长黄酮提取率逐渐增加，当提取时间为3h时，黄酮的提取率最高，但继续增加提取时间时，提取率反而有所下降，长时间受热会破坏有效成分，杂质含量可能也相对增加。因此，实验确定最佳提取时间为3 h。

2.1.3液料比的改变对牛蒡黄酮提取率的影响

用60%乙醇，分别以液料比1：5、1：10、1：15、1：20、1：25进行提取，温度控制在60℃，提取3h，可以看出，随提取液料比的增加，黄酮提取率逐渐增大，在1：20时提取率最大。如表4所示。过多的溶剂使得杂质含量变大，并且给后序的浓缩带来困难。因此，本实验确定最佳液料比为1：20。

2.1.4提取温度的改变对黄酮提取率的影响

用60%乙醇，1：20液料比，分别在40℃、50℃ 、60℃ 、70℃、80℃的条件下提取3h，测定总黄酮的提取率。结果（见表5）表明，随着温度的升高，总黄酮提取率存在一个极大值，当温度为60℃时，提取率最高。温度过高，活性成分易被破坏。因此，较佳的提取温度定在60℃。

2.2牛蒡总黄酮提取工艺条件优化

2.2.1正交试验法优化牛蒡黄酮提取工艺条件结果

选取料液比、提取时间、提取温度、乙醇浓度为考察因素，以提取铁皮石斛总黄酮的质量分数为考察指标，进行四因素三水平正交实验，确定最佳工艺条件参数。

通过上述试验可以得到：R2>R1>R3>R4，即提取温度对牛蒡总黄酮的提取影响最大，乙醇浓度次之，时间对牛蒡总黄酮提取影响第三，液料比对牛蒡总黄酮的提取率影响相对较小。表中4因素的水平组合情况，在A3B3C1D2组合条件下提取率最高，最佳组合即料液比1：15，提取时间2h，提取温度60℃，乙醇浓度60%。

3.结论

通过单因素试验和正交试验得出了牛蒡总黄酮最优的提取条件：温度60℃，料液比1：15，时间2h，乙醇体积分数60%。牛蒡是一种中度耐盐的植物，随着对其活性作用的研究的不断深入，生产出高附加值的保健品，具有客观的经济效益和社会效益[4]。

参考文献：

[1] 魏东，王连翠.牛蒡根的研究进展[J]，安徽农业科学，2006，34（15）：3716-3717.

[2] 马鲁豫，马振环.牛蒡根化学成分的提取、分离和鉴定[J]，山东医药，2011，51（19）：44.

[3] 孟楣，廖自荣，周建理.牛蒡的生药学研究[J].基层中药杂志，2000，14（4）：27-28.

[4] 谢辉，李霞等.牛蒡有效成分的提取及活性研究进展[J].中国现代药物应用2010，4（23）：238-239

基金项目：

湖北省自科基金项目（2009CD155），湖北民族学院科技学院大学生创新课题（K201126）。

作者简介：

武芸（1971.4-）：通讯作者，女，理学硕士，副教授，主要从事植物生物技术及生物资源保护与利用的教学与研究。