正交试验法优选感冒药茶颗粒的提取工艺

黄权芳* 林 兴韦振源刘 倩言开武

（1 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2 广西医科大学，广西 南宁 530021；3 桂林医学院，广西 桂林 541004）

正交试验法优选感冒药茶颗粒的提取工艺

黄权芳1* 林 兴2韦振源1刘 倩1言开武3

（1 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2 广西医科大学，广西 南宁 530021；3 桂林医学院，广西 桂林 541004）

目的 优选感冒药茶颗粒的提取工艺，以便制备质量稳定的制剂。方法 以加水量，提取时间，提取次数为考察因素，以总黄酮及熊果酸和浸膏量为指标，采用L9（3）4正交试验法对感冒药茶颗粒的最佳提取工艺进行优选。结果 该制剂最佳提取工艺为加水量10倍，提取3次，每次提取时间60min。结论 该提取工艺合理可行，稳定可控，适用于大生产，是最佳制备工艺。

正交试验；提取工艺；感冒药茶颗粒

感冒药茶颗粒是由广西中医药大学第一附属医院院内制剂感冒药茶的基础上进行的剂型改革。方源于我院民间科医生的经验方，由桑叶、菊花、薄荷、山芝麻、岗梅根等药材组成。具有清热解毒，平肝明目，解热抗炎的功效，能缓解感冒引起的发烧咽痛、周身骨痛、头重乏力、胸闷食滞、恶心呕吐等症状，对风热挟湿证感冒的临床疗效确切，无毒副反应，值得临床推广应用。由于茶剂在制备过程中微生物不易控制及储存过程中挥发性成分易挥发和药粉渗出污染滤袋而影响外观等缺点，本课题组尝试在此基础上进行剂型改革，将其开发研制成颗粒剂，这样保持了煎剂的优点，又省去煎煮的麻烦，服用方便，也符合感冒用药特点，又便于携带与保存，无霉变之虑，发挥着中医中药辨证论治在防治外感疾病方面的优势作用。在进行剂型改造的过程中，颗粒的提取工艺研究是本课题的组成部分之一。由于处方中各药材的主要有效成分以总黄酮、熊果酸等的含量较为显著，同时还要考虑颗粒的成型，我们采用正交试验法以总黄酮及熊果酸含量，浸膏得率为考察指标，对提取工艺进行了优选，以确定新剂型的最佳提取工艺。

1 仪器与试药

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），GH-252电子分析天平（日本A&D公司）；药材（广西柳州市神农中药饮片厂），经广西中医大学中药鉴定教研室腾建北副教授鉴定符合《中国药典》2010年版一部各品种项下标准。芦丁对照品（批号：100080-200707中国药品生物制品检定所），熊果酸对照品（批号：110742-200518中国药品生物制品检定所），岗梅根对照药材（中国药品生物制品检定所，121152-200502）水为纯化水，所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 单因素试验

本实验采用加水煎煮进行提取，以总黄酮为指标，分别考察了加水量、提取时间、提取次数等因素对提取率的影响。

2.1.1 加水量对提取率的影响，加水量为10倍时提取率最高。

2.1.2 提取时间对提取率的影响，提取时间为60min时提取率最高。

2.1.3 提取次数对提取率的影响，提取次数为3次时提取率最高。

2.2 正交试验设计

根据传统工艺采用水煎煮，浸泡时间为30min。依据单因素试验的结果，以加水量（A）、提取次数（B），提取时间（C）、为考察因素，以总黄酮含量、熊果酸含量、浸膏得率为综合评价指标，采用L9（3）4正交设计安排试验，工艺水平安排见表1。

表1 正交试验因素表

2.3 样品提取液的制备

按照处方配比1/5量称取药材，共9份，提取前均浸泡30min，按正交试验表安排实验进行提取，合并提取液，滤过，合并滤液浓缩定容至1000mL，得感冒药茶提取液，备用。

2.4 总黄酮含量的测定[1-3]

2.4.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品6.8mg，置于25mL的容量瓶中，加70%乙醇溶液溶解并稀释至刻度线，摇匀，得芦丁对照品溶液（272μg/mL），备用。

2.4.2 样品溶液的制备

精密吸取提取液2mL，水浴蒸干溶剂，加适量70%乙醇溶解，转移至25mL容量瓶内，加70%乙醇至刻线，摇匀，得感冒药茶样品溶液，备用。

2.4.3 黄酮测定波长的选择

精密吸取芦丁对照品溶液2.0mL置于25mL容量瓶中，加水至6mL，精确加入5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min；精确加入10%氯化铝溶液1mL，摇匀，放置6min；精确加入4.3%氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度线，摇匀，放置15min。

精确吸取感冒药茶样品溶液2.0mL，置于25mL容量瓶内，加水至6mL，精确加入5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min；精确加入10%氯化铝溶液1mL，摇匀，放置6min；精确加入4.3%氢氧化钠试液10mLl，再加水至刻线，摇匀，放置15min。

用TU-1901双光束紫外可见分光光度计在200nm～900nm波长范围内扫描，结果对照品溶液与样品溶液在515nm处均有最大吸收峰，故选择515nm为测定波长。

2.4.4 芦丁标准曲线的制备

精密吸取芦丁对照品溶液0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置于25mL容量瓶中，各加水6mL，精确加入5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min；精确加入10%氯化铝溶液1mL，摇匀，放置6min；精确加入4.3%氢氧化钠试液10mL，再加水至刻线，摇匀，放置15min，以试剂为空白，照分光光度法试验，于515nm的波长处测定吸收度，以吸收度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得标准曲线：C=102.1495A+3.0132（R2=0.9986）。芦丁在5.44～54.40μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验

精密吸取同一芦丁对照品溶液2mL共5份，分别置于不同的25mL容量瓶中按 “2.4.3”项下，从“各加水至6mL……”起操作，测定吸光度，结果芦丁标的平均吸光度A为0.1769，RSD为1.48%（n=5）。

2.4.6 重现性试验

精密移取同一批号的样品溶液2mL共5份，按“2.4.3”项，从“分别置于25mL容量瓶中”起操作，测定每个容量瓶中的总黄酮浓度，结果总黄酮的平均浓度为35.64μg/mL-1，RSD为0.18%（n=5）。

2.4.7 稳定性试验

按照“2.4.3”项下方法制备感冒药茶样品供试溶液，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计于室温（26℃）下每隔10min测定一次总黄酮的浓度，结果吸光度A在50min内无明显变化，RSD为 2.9264%，表明在显色后50min内稳定性良好。

2.4.8 加样回收率试验

精密移取总黄酮浓度为12.734ug/mL的样品溶液5份，每份0.5mL，水浴蒸干，用70%乙醇溶解，转移至25mLl容量瓶中，再分别加入浓度为400μg/mL的芦丁对照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，按照“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，测定其总黄酮浓度。平均回收率为107.56%，RSD为2.62%。

2.4.9 感冒药茶样品总黄酮的含量测定

精密吸取样品2mL，水浴蒸干溶剂，加适量70%乙醇溶解，转移至25mL容量瓶内，加70%乙醇至刻线，摇匀备用。

精确吸取上述溶液2mL共3份，分别置于不同的25mL容量瓶内，各加水至6mL，精确加入5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min；精确加入10%氯化铝溶液1mL，摇匀，放置6min；精确加入4.3%氢氧化钠试液10mL，再加水至刻线，摇匀，放置15min，在515nm处测定吸光度A，计算含量，取平均值。

2.5 熊果酸的含量测定

2.5.1 样品溶液的制备

取感冒药茶样品溶液0.2mL水浴挥干溶剂，在60℃的烘箱中除去水汽，精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，高氯酸1.0mL，于60℃水浴中反应15min，立即置于冰浴中冷却，精确加入冰醋酸5.0mL，摇匀，既得。

2.5.2 岗梅根对照药材溶液的制备[4]

称取岗梅根对照药材3.3g，加水100mL水提取3次，每次1h，过滤，浓缩至100mL得岗梅根对照药材溶液，取0.2mL水浴挥干溶剂，在60℃的烘箱中除去水汽，精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，高氯酸1.0mL，于60℃水浴中反应15min，立即置于冰水中冷却，精确加入冰醋酸5.0mL，摇匀，既得。

2.5.3 熊果酸对照品溶液制备

精密称取熊果酸对照品5.5mg，置于25mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻线，摇匀，得熊果酸对照品溶液（220μg/mL）。

2.5.4 测定波长的选择[5]

精密吸取熊果酸对照品溶液0.5mL置于试管中，水浴挥干溶剂，在60℃的烘箱中除去水汽，精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，高氯酸1mL，于60℃水浴中反应15min，立即置于冰水中冷却，精确加入冰醋酸5mL，摇匀，既得。

A.用TU-1901双光束紫外可见分光光度计在400nm～800nm波长范围内扫描，结果熊果酸对照品溶液、岗梅根对照药材溶液与感冒药茶样品溶液在550nm处均有最大吸收峰，故选择550nm为测定波长。

2.5.5 熊果酸标准曲线的制备

精密吸取熊果酸对照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL分别置于试管中，按“2.5.1”项下，从“水浴挥干溶剂……”起操作，以试剂为空白，照分光度法（《中国药典》2010版一部：附录ⅦA）试验，于550nm的波长处测定吸收度，以吸收度A为纵坐标，熊果酸浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得标准曲线：C=14.3372A+0.7328（R2=0.9992），熊果酸在3.49～27.94μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.5.6 精密度试验

精密吸取同一熊果酸对照品溶液0.3mL共5份，置于不同的试管中，按“2.5.1”项下，从“水浴挥干溶剂……”起操作，测定吸光度，结果熊果酸的平均吸光度A为0.6768，RSD为0.69%。

2.5.7 重现性试验

精密吸取同一批号的样品溶液0.2mL共5份，分别置于试管中，按“2.5.1”项下，从“水浴挥干溶剂……”起操作，测定每支试管中溶液的熊果酸浓度，结果熊果酸平均浓度为17.46μg/mL，RSD为1.58%。

2.5.8 稳定性试验

按照“2.4.1”项下方法制备样品供试溶液，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计于室温（26℃）下于0h，1h，2h，3h，4h，5h测定熊果酸的吸光度，RSD为1.49%，测定结果表明样品在显色后5h内稳定性良好。

2.5.9 加样回收率试验

精密移取熊果酸浓度为9.93μg/mL的样品溶液5份，每份0.1mL，再精密加入浓度为 500μg/mL的熊果酸对照品溶液0.05mL，0.1mL，0.15mL，0.2mL，0.25mL，按照“2.5.1”项下方法制备供试品溶液，测定熊果酸平均回收率为97.69%，RSD为1.41%。

2.5.10 感冒药茶样品中熊果酸的含量测定

精确吸取样品0.1mL5份于不同试管中，在水浴中挥干溶剂，后在60℃烘箱中除去水汽，精确加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，高氯酸1mL，置60℃水浴中反应15min，立即置于冰水中冷却，再精确加入冰醋酸5mL，摇匀，在550nm处测定吸光度A，计算含量，取平均值。

2.6 评分标准

方中总黄酮和熊果酸为主要成份，将测定总黄酮、熊果酸作为主要确定提取效率的总体优化指标；考虑到本品是复方制剂，为了对水煎煮工艺提取效率有个总体的控制，故增加浸膏率作为另一个工艺优化的总体指标。以3项指标为综合评分，规定综合评分满分为100分，其中总黄酮、熊果酸含量分别占综合评分的40%，以总黄酮、熊果酸含量最高为满分分别为40分；浸膏率占综合评分的20%，以最高者为满分20分。

2.7 最佳工艺验证试验

为考察上述优选提取工艺的稳定性，按照处方配比五分之一量称取药材3份，浸泡30min，加水10倍，每次煎煮60min，提取3次。分别测定总黄酮的平均浓度为34.92μg/mL，RSD为0.38%；熊果酸的平均浓度为16.12μg/mL，RSD为2.55%；干膏平均得量为2.78，RSD为3.97%。结果表明：用优选的工艺条件提取，这3份药材的提取率均达到了较高水平，且工艺稳定，适用于大生产。

3 讨 论

3.1 感冒药茶由桑叶、菊花、薄荷、山芝麻、岗梅根等药材组成。具有清热解毒，平肝明目，解热抗炎的功效，能缓解感冒引起的发烧咽痛、周身骨痛、头重乏力、胸闷食滞、恶心呕吐等症状，对风热挟湿证感冒的临床疗效确切。处方中桑叶、菊花为主要药物，桑叶中含有丰富的槲皮素类活性成分，黄酮类化合物含量丰富。菊花中亦富含黄酮类物质，以2-苯基色原酮为基核的化合物，是一类极具有开发前景的天然有机抗氧化剂[6-8]。目前研究证实，黄酮类成分具有良好的抗菌、抗病毒的作用[9]，此外岗梅根中含有熊果酸[10]，且黄酮类及熊果酸等成分可溶于水[11]。故将总黄酮、熊果酸等作为确定提取效率的总体优化指标，采用水提取工艺，适合该制剂的实际生产。

3.2 正交设计是一种高效、快速的多因素试验设计方法，以多个指标成分作为考察因素，可用最少的试验次数筛选出最佳试验条件。同时还应结合批量生产的实际，在经济，有效的前提下确定最佳工艺。本实验以总黄酮、熊果酸含量和浸膏率为评价指标，采用正交试验对提取工艺进行优化。结果发现，影响提取效果最主要的因素是提取次数，其次是加水量，提取时间影响不显著。考虑到有效成分含量与疗效关系以及生产成本，确定感冒药茶的最佳提取工艺条件为A2B3C1。提取工艺验证试验也得以证实，优选的最佳提取工艺具有良好的连续性、稳定性和可操作性，该实验结果可为今后的生产提供理论指导。

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Extracting Techniques for Ganmao Yaocha by Orthogonal Text

HUANG Quan-fang1*, LIN Xing2, WEI Zhen-yuan1, LIU Qian1, YAN Kai-wu3
(1 The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University, Nanning 530023, China; 2 Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 3 Guilin Medical University, Guilin 541004, China)

Objective To optimize techniques for Ganmao Yaocha granule, Preparation and stability so as to the quality of preparation. Methods The amount of water, extraction time and frequency as variables, By taking the rate of extract and the total of flavonoids, ursolic as the indexes components, the extraction techniques were optimized for Compound rhubarb enema through L9（3）4orthogonal test. Results The best condition is 3 times to boil with water, each 10 times,1 hours. Conclusion The preparation technology is feasible and reliable for the manufacturing process of Compound rhubarb enema.

Orthogonal test; Extraction process; Ganmao Yaocha Granules

R285.1

B

1671-8194（2013）27-0004-03

广西壮族自治区卫生厅项目GZYZ1204

*通讯作者