他汀类药物预处理时间对兔心肌缺血再灌注损伤的影响

陈红霞，曹 霞，卢 红，汪 蕾

(1湖北科技学院基础医学院，湖北咸宁437100;2湖北中医药大学检验学院)

急性心肌梗死发生后，通过溶栓等疗法早期恢复缺血部位的血供能够挽救缺血的心肌细胞、防止梗死范围的扩大。但是复灌会造成心肌细胞损伤加重的现象［1］。目前已经证实多种中西药具有减轻缺血再灌注损伤的疗效，其中，他汀类药物的疗效尤为突出［2，3］。他汀类药物是广泛应用的降脂类药，通过抑制脂类合成的限速酶减少其合成［4］。其治疗缺血再灌注损伤的机制主要是通过上调血管内皮细胞合成内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)，从而增加内皮型NO的释放达到舒张血管和减少炎症细胞浸润［5］。他汀类药物可能通过p-Akt信号通路，在短时间内上调人脐静脉内皮细胞(HUVECs)合成eNOS。这种诱导上皮细胞快速表达eNOS的反应性表明在溶栓治疗前紧急应用他汀类药物对于减轻缺血再灌注损伤有很好的疗效。在应用他汀类药物治疗缺血再灌注的动物实验中，药物的预处理时间存在较大差异［6～10］，不同的预处理时间与疗效之间的关系并不清楚。2012年1月～2013年6月，我们对他汀类药物不同预处理时间对兔心肌缺血再灌注损伤的影响进行了研究。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 主要实验材料 健康雄性日本大耳白兔70只(体质量2．0～2．5 kg/只，湖北科技学院动物房提供);人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)、内皮细胞完全培养液(ECM)购自美国ScienCell Research Laboratories。eNOS(H195)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。兔抗p-Akt抗体(3257-100)购自BIOVISION公司，兔抗actin抗体(SC-1616)以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗购自Santa Cruz公司。ECL显色液和RIPA蛋白裂解液购自碧云天公司。普伐他汀、阿托伐他汀和氟伐他汀分别由上海施贵宝、辉瑞制药和诺华制药有限公司生产。全自动凝胶图像处理系统(Pharmacia公司，Imagemaster VDS)，紫外分光光度计(日本岛津公司，UV-2450)。

1．2 他汀类药物对缺血再灌注损伤大鼠的影响

1．2．1 动物分组及给药方法 将每种他汀药物组21只实验兔按缺血再灌注前5 d、缺血再灌注前3 d和缺血再灌注前2 h灌胃。分别给予普伐他汀(普伐他汀组)、阿托伐他汀(阿托伐他汀组)和氟伐他汀(氟伐他汀组)，每组7只每种药物经40℃生理盐水制成混悬液，以10 mg/kg灌胃，对照组7只给予等量生理盐水灌胃。

1．2．2 心肌梗死模型制备 各组实验动物灌胃后在相应时间经20%乌拉坦腹腔麻醉(3 mL/kg)，通过连接电生理记录仪实时观察心电图。暴露心脏的同时保持胸膜的完整，显露出冠状动脉的左室支，用缝线穿绕左前降支并在血管和结扎线之间放置硅胶管，结扎至左室壁颜色变暗，以心电图ST段弓背上抬、T波高耸为出现心肌缺血。40 min后放松结扎线，再灌注2 h直至ST段较最高值下降幅度超过1/2，表明再灌注成功。

1．2．3 各组心肌梗死范围测定 再灌注结束后阻断冠状动脉血流，采用伊文思蓝进行心肌染色，将未染成蓝色的缺血区心肌分离后置于1%TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)磷酸缓冲液内，其中灰白色为坏死区，深红色为非坏死区。将两者分离后分别称重。以坏死区占左室质量的百分比表示为梗死比率(%)并以此评价心肌梗死范围。

1．2．4 eNOS活性检测 取缺血区相应部位心肌组织各200 mg，制成组织匀浆并按照试剂盒说明以分光光度法测定和计算eNOS活性。

1．3 他汀类药物对体外HUVECs的影响

1．3．1 HUVECs培养 HUVECs置于37℃、含5%CO2的空气培养箱中培养。待细胞长至70%融和状态后用0．125%胰酶和0．02%EDTA消化传代，取3～5代处于生长对数期的细胞用于实验。

1．3．2 细胞分组及其eNOS活性检测 将细胞分为普伐他汀组、阿托伐他汀组、氟伐他汀组及对照组，前三组为实验组。他汀类药物磨碎称重后，溶解于有机溶剂(由 0．1 mL 95%甲醇与 0．15 mL 0．1 mmol/L的NaOH配制)中，50℃水浴加热2 h后，通过Hcl调节PH至7．2。将普伐他汀、阿托伐他汀和氟伐他汀分别加入各组HUVECs培养基中，对照组加培养液，使培养液终浓度为5μmol/L。在0、5、15、20、30 min时收集 HUVECs，用 4 ℃ 预冷的 PBS洗涤3次，破碎细胞后分光光度法检测eNOS活性，具体按试剂盒说明书操作。

1．3．3 HUVECs内p-Akt检测 他汀类药物的溶解及使用浓度同1．3．2。将普伐他汀、阿托伐他汀和氟伐他汀分别加入各组HUVECs培养基中，15 min后收集细胞。裂解细胞并提取总蛋白，测量蛋白浓度后每组上样量为80μg，经Westernblot检测各组p-Akt的表达。

1．4 统计学方法 采用SPSS11．0统计软件进行统计分析，所有实验数据以¯x±s表示，两组间均数比较用F检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 不同给药时间对动物心肌梗死面积的影响提前5 d和3 d给予他汀类药物(普伐他汀、阿托伐他汀和氟伐他汀)一次性预处理，缺血再灌注后，心肌梗死面积较对照组无统计学差异。提前2 h给予他汀类药物预处理，缺血再灌注后，心肌梗死面积较对照组下降(P＜0．05)。见图1。

图1 不同时间他汀类药物预处理对心肌梗死范围的影响

2．2 各组动物心肌组织eNOS表达比较 普伐他组、阿托伐他汀组预处理缺血再灌注后，心肌内eNOS的活性较对照组没有统计学差异。氟伐他汀组预处理缺血再灌注后，心肌内eNOS的活性较对照组升高(P＜0．05)。见图2。

图2 不同时间一次性给予他汀类药物预处理对心肌中eNOS活性的影响

2．3 他汀类药物对HUVECs内eNOS活性的影响

加入各他汀类药物后，细胞内的eNOS活性在20 min内即上升，呈快速的时间依赖性。而对照组eNOS没有上升。见图3。

图3 他汀类药物对细胞内eNOS的影响

2．4 他汀类药物对HUVECs内p-Akt表达的影响

加入他汀类药物后，各组细胞内p-Akt的表达较对照组增加(P＜0．05)。见图4。

图4 他汀类药物对细胞内p-Akt的影响

3 讨论

冠状动脉堵塞导致局部血流中断，心肌细胞发生不可逆性的坏死。通过溶栓和放置支架等治疗措施能够及时恢复血流供应，挽救缺血的心肌细胞、避免梗死范围的扩大。但是在恢复血流后，心肌细胞会出现再灌注性损伤。在动物实验中，多种他汀类药物经证实能减轻缺血再灌注损伤。但在给药时机选择上，差别较大。从实验前的连续性给药到实验前甚至前3 min的一次性预处理给药都有报道［11～13］。在本研究中，我们发现一次性的预处理给药，无论是普伐他汀、阿托伐他汀还是氟伐他汀，实验前2 h的灌胃即能显著减少梗死面积。而提前5 d和3 d的一次性给药对于缺血再灌注损伤没有治疗效果。

他汀类药物用于治疗缺血再灌注损伤的主要机制在于增加心肌局部eNOS的活性。由eNOS诱导生成的NO具有舒张血管、减少血管内皮细胞表达黏附分子并减轻炎症细胞浸润的作用，从而减轻心肌组织在再灌注过程中的炎症损伤。本研究发现，实验前2 h灌胃即能显著增加损伤心肌eNOS表达，而提前5 d和3 d的一次性给药相对与对照组而言，心肌组织eNOS表达没有统计学差异，表明实验前2 h的预处理通过迅速提高心肌内的eNOS发挥疗效。在心肌内，血管内皮细胞是合成eNOS的重要来源。在细胞实验发现，给予血管内皮细胞系他汀类药物，发现在短时间内即能迅速上调细胞内eNOS的活性，提示他汀类药物能上调eNOS从而增加NO的合成具有快速反应性。

eNOS的含量和活性受到多种因素的影响。通过磷酸化活化其上游的信号分子Akt等能增加其表达或者迅速使eNOS转化为活性形式 p-eNOS［14］。本研究发现，他汀类药物能够迅速增加Akt的磷酸化形式(p-Akt)，提示他汀类药物使Akt信号分子磷酸化，后者上调了eNOS或使其转化为活性形式。此外，在一些动物实验中，连续多天的他汀类药物预处理同样能减轻缺血再灌注损伤［15］，提示其提高了eNOS的合成。这与我们的实验并不矛盾，但是他汀类药物在短时间内上调eNOS的合成或增加其活性形式对临床的指导意义更为重要。对于心梗这一突发性的心血管事件，在发生后的急性期，在溶栓治疗前一次性的预处理给药对于减轻缺血再灌注损伤即有很好的疗效。

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