冬虫夏草与蛹虫草融合子菌丝体液体培养基筛选

2013-06-20曲鸿雁郭成金

中国酿造 2013年3期

曲鸿雁，郭成金

（天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

冬虫夏草隶属于真菌界（Kingdom Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、核菌纲（Pyrenomycetes）、麦角菌目（Clavicipitales）、麦角菌科（Clavicipitaceae）、虫草属[Cordyceps（Fr.）Link.]。是一种稀有的纯寄生性真菌。虫草菌侵染的寄主为鳞翅目（Lepidoptera）、蝙蝠蛾科（Hepialidae）、蝙蝠蛾属（Hepialus）的昆虫。主要分布在我国青藏高原区域的西藏、青海、四川、云南、贵州等省及周边的高寒地带[1]。因寄生性严格，对生态环境的要求高，故产量很低，现还没有实现大规模栽培[2-6]。由于其独特的食用价值和显著的滋补疗效，使得冬虫夏草的市场价格日益飙升，天然冬虫夏草资源锐减[1]。

蛹虫草也称北冬虫夏草，分布较广，在我国吉林、河北、陕西、安徽、广西等省区均有分布[7]。其营养成分和药用价值与冬虫夏草相似，和冬虫夏草同属异种。蛹虫草现已实现大规模人工培养[8]。

郭成金等[6]将冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合后，获得冬虫夏草与蛹虫草融合子。以其为研究对象，为获得最适液体培养基配方，作者在不同碳氮源、无机盐及维生素水平条件下，对液体培养基进行了筛选；比较了静止、动静相间、持续摇动3种培养方法，筛选有利于菌丝体生长的培养基，为获得大量原生质体，诱变育种以及菌体的规模发酵生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种：冬虫夏草[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]与蛹虫草[Cordycepsmilitaris（L.ex Fr.）Link.]融合子，由天津师范大学蕈菌研究所提供。

1.2 主要试剂

葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、VB1，以上均为分析纯。马铃薯、红糖、棉籽皮、黄豆粉、麦麸。

1.3 试验仪器

YXQG02手提式压力蒸汽消毒器（山东新华医疗器械厂），WDP型微生物多用培养箱（广东省医疗器械厂），SW-CJ-2FD双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司），BS224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统股份有限公司），AP-01D真空泵（天津奥特塞恩斯仪器有限公司），DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.4 培养基

1.4.1 综合培养基

PDA培养基，pH值自然。

1.4.2 碳源初选培养基

酵母粉0.20%，KH2PO40.10%，MgSO4·7H2O 0.05%，VB10.0004%，pH值自然。分别以葡萄糖0.50%，蔗糖0.50%，红糖0.50%，甘露醇0.50%，麦芽糖0.50%，马铃薯5%（浸提液）为供试碳源。

1.4.3 氮源初选培养基

葡萄糖2.00%，KH2PO40.10%，MgSO4·7H2O 0.05%，VB10.0004%，pH值自然。分别以蛋白胨0.10%，酵母粉0.20%，牛肉膏0.25%，黄豆粉1.00%（浸提液），麦麸1.00%（浸提液）为供试氮源。

1.5 试验方法

1.5.1 菌种活化及菌丝体的液体培养

将菌种提前5d～6d活化，接种于PDA培养基平板上，25℃培养约14d。用打孔器在生长旺盛的菌丝体前端，切割大小相同直径为Φ8mm的菌块，接种于液体培养基（50/100mL锥形瓶），每瓶接5块，25℃静置12h，后每隔12h水平往复手摇约5min，转速一般控制在50r/min～80r/min。培养156h，每个水平3次重复。

1.5.2 菌丝体干重的测量

将培养156h的菌丝体抽滤，于60℃烘箱中烘干2h至恒重，称重并记录。

1.5.3 碳氮源培养基正交试验

依据初选中碳氮源单因素试验结果，各选2个较好的碳氮源，按L9（34）设计4因素3水平试验进行复选，与KH2PO40.10%，MgSO4·7H2O 0.05%，VB10.0004%组成9个试验配方，筛选出最佳碳氮源组合。正交因素与水平见表1。

表1 正交试验因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5.4 无机盐及维生素水平试验

根据碳氮源正交试验的结果，选出最佳碳氮源组合作为基础培养基，向其中添加不同浓度的KH2PO4、MgSO4·7H2O和VB1，见表2。

1.5.5 培养方法对比试验

应用筛选出的最佳配方，以静止、动静相间（每隔12h水平往复手摇约5min）和持续摇动（120r/min）3种方法培养，观察菌丝体的生长情况。

表2 无机盐及VB1因素与水平试验Table 2 Factors and levels experiment of inorganic salt and VB1

2 结果与分析

2.1 碳源对虫草融合子菌丝体生物量的影响

试验结果（表3）表明，在6种供试碳源中，以蔗糖为碳源菌丝体生物量最高，葡萄糖、甘露醇次之，其次为麦芽糖、红糖，马铃薯最低。经统计学方差分析（表4），F值为6.645，大于F（5，12）0.05=3.106，F（5，12）0.01=5.064[9]，表明不同碳源培养基对虫草融合子菌丝体生物量的影响在0.01水平上差异显著。应用Duncan检验法多重比较结果表明，葡萄糖、蔗糖、甘露醇与马铃薯、红糖、麦芽糖之间在0.01水平上差异极显著，所以选择葡萄糖和蔗糖，进行下一步碳氮源的正交试验。

表3 不同碳源对菌丝体生物量的影响Table 3 Effect of different carbon source on the Mycelial Biomass

表4 不同碳源配方下菌丝体生物量的方差分析Table 4 Variance analysis of mycelium biomass under different carbon source

2.2 氮源对虫草融合子菌丝体生物量的影响

氮源是合成蛋白质和核酸等物质的必要原料，是细胞生长的物质基础。因菌丝体对有机氮的利用优于无机氮[10]，故供试氮源均设为有机氮源。试验结果（表5）表明，在供试的5种有机氮源中，黄豆粉获得的菌丝体生物量最高，次之是酵母粉、蛋白胨，其次是麦麸，牛肉膏最低。经统计学方差分析（表6），F值为52.978，大于F（4，10）0.05=3.478，F（4，10）0.01=5.994[9]，表明不同氮源培养基对虫草融合子菌丝体生物量的影响在0.01水平上差异显著。应用Duncan检验法多重比较结果表明，除麦麸和牛肉膏之间差异不显著外，其余各供试氮源之间在0.01水平上均有极显著差异，所以选择黄豆粉和酵母粉，进行下一步碳氮源的正交试验。

表5 不同氮源菌丝体生物量的影响Table 5 Effect of different nitrogen source on the mycelial biomass

表6 不同氮源配方下菌丝体生物量的方差分析Table 6 Variance analysis of mycelium biomass under different nitrogen source

2.3 碳源、氮源正交试验结果

表7 L9（34）正交试验结果与分析Table 7 Results and analysis of L9（34）orthogonal design

分析表7正交试验极差值（R）可知，葡萄糖的极差最大，其次是酵母粉、蔗糖、黄豆粉。极差越大，在该因素的水平变动时，菌丝体生物量变化越大，也就是该因素对生物量变化影响越大[11]。可见碳源葡萄糖是影响菌丝生物量的主要因素。碳源是构成细胞基本骨架的营养物质，同时也为基本生命过程提供能源，葡萄糖属于单糖，可被细胞直接吸收利用。表中K1、K2、K3之间的差异是因素取3个不同水平所引起的，K值大的因素水平是较好的培养条件[12]。比较水平之间K值大小，得到最佳水平组合为A2B2C3D2，即葡萄糖5.00g/L，蔗糖5.00g/L，酵母粉0.25g/L，黄豆粉5.00g/L（浸提液）。

2.4 无机盐及VB1使用量筛选结果分析

表8 无机盐及维生素B1用量对菌丝体生物量的影响Table 8 Effect of inorganic and VB1 on the Mycelial Biomass

MgSO4在微生物培养中是常用的营养源，镁离子是许多酶的活化剂。KH2PO4在真菌培养基中除提供必需矿质营养外，还对培养基的pH值具有缓冲作用[13]。经统计学分析可以看出（表8），各处理组之间并无显著性差异，低剂量组（处理1）与高剂量组（处理4）作用相当，表明无机盐的添加只需少量即可满足虫草融合子菌丝体的生长需要。所以确定最佳液体培养基配方的无机盐与维生素水平为KH2PO41.50g/L，MgSO4·7H2O 0.50g/L，VB14mg/L。

2.5 不同培养方法对菌丝体生长的影响

表9 培养方法对菌丝体生物量的影响Table 9 Effect of cultural methods on the Mycelial Biomass

由试验结果（表9）可以得出，3种培养方法中持续摇动培养的菌丝体生物量最高。经统计学方差分析（表10），F值为39.364，大于F（2，6）0.05=5.143，F（2，6）0.01=10.92[9]，表明不同培养方法对菌丝体生物量的影响在0.01水平上差异显著。

表10 不同培养方法下菌丝体生物量的方差分析Table 10 Variance analysis of mycelium biomass under different cultural methods

对培养基中菌丝体形态观察得知，持续摇动培养的菌丝体呈白色粘稠状，与培养基分界面不明显；动静相间培养的菌丝体呈絮状均匀分散，与培养基形成清晰的分界面；静止培养的培养基中因通气量小，菌丝体生长量较少。3种培养方法所得液体菌种见图1。

图1 不同培养方法的对比（a.静止b.动静相间c.持续摇动）Fig.1 Comparative analyses on cultural methods（a.Stationary b.Swang by handsc.Shaking cultivation）

3 讨论

子囊菌中分生孢子普遍存在[14-15]。通过显微镜对虫草融合子菌丝的观察发现营养生长阶段的菌丝可产生外生芽殖型分生孢子（图2）。在3种培养方法中，动静相间法可使孢子规律的分散在培养基中并间断通氧，降低持续摇动对细胞的损伤，减少分泌物的生成。

图2 虫草融合子的外生芽殖型分生孢子Fig.2 Holoblastic conidia of fusant

丝状真菌的菌丝片段可用于原生质体的制备。3种培养方法中，持续摇动法获得的菌丝体粘稠，不易从培养基中分离；动静相间法获得的菌丝体在培养基中分散均匀，有利于菌丝片段的分离；静止培养法中获得的菌丝片段较少。

4 结论

试验结果表明，虫草融合子最适液体培养基组合为葡萄糖5.00g/L，蔗糖5.00g/L，酵母粉0.25g/L、黄豆粉5.00g/L（浸提液），KH2PO41.50g/L，MgSO4·7H2O0.50g/L，VB14mg/L，pH值自然。25℃、120r/min持续摇动培养156h，其菌丝体生物量可达3.51g/L。

在培养方法的比较中，持续摇动培养法获得菌丝体生物量最多，利于菌体的规模发酵生产；动静相间法次之；静止法获得量较少。动静相间法所培养的菌丝体更有利于原生质体的制备和诱变育种。

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