系统性红斑狼疮患者外周血中OX40、OX40L mRNA的表达及意义

李桂珍，赵俊芳，陈雪雯，王 蓉，王玉亮

(1天津市中医药研究院附属医院，天津300120;2天津市第一中心医院)

系统性红斑狼疮(SLE)是多种因素相互作用引起的自身免疫性疾病，其发病机制复杂，与免疫调节异常有关［1］。OX40/OX40L是机体免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子，参与了T细胞的活化、增殖、迁移以及生发中心的形成和树突状细胞的分化成熟，在机体的免疫应答和多种疾病中具有重要作用。Farres等［2］研究发现，OX40/OX40L与 SLE的发病密切相关。2012年6～11月，我们检测了30例SLE患者及15例健康体检者外周血 OX40、OX40L mRNA的表达，并对OX40/OX40L与SLE疾病活动程度的关系进行评估。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择天津市第一中心医院收治的SLE患者30例(SLE组)，均为女性，年龄(36±7)岁，均符合1997年美国风湿病协会修订的SLE分类标准。所有入选患者不伴有其他风湿性、代谢性和内分泌疾病。根据SLE疾病活动指数(SLEDAI)评估疾病活动程度，SLEDAI≥10分为活动期，共15例，均为初诊未治的初发活动期SLE患者或复发尚未再次治疗的活动期SLE患者;SLEDAI＜10分为非活动期，共15例。同期选择该院健康体检女性15例作为对照组，年龄(33±7)岁。本研究经过本院伦理委员会批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 异硫氰酸荧光素—小鼠抗人CD38单克隆抗体、藻红蛋白—小鼠抗人CD3单克隆抗体(Biocytex公司，法国)，ABI 7300 PCR扩增仪(Applied Biosystems公司，美国)。FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)。

1.2.2 外周血OX40、OX40L mRNA表达检测 采用荧光定量RT-PCR法。所有研究对象于清晨空腹采集外周静脉血，乙二胺四乙酸抗凝。应用TRIzol试剂(GIBCO-BRL公司，美国)提取外周血单个核细胞总 RNA，按逆转录酶说明书操作合成 cDNA。OX40上游引物:5'-ACGACGTGGTCAGCTCCAA-3'，下游引物:5'-TCCGCTCACTCCCACTTCTG-3'，探针序列:5'-AAGCCCTGCACGTGGTGTAACC-3';OX40L上游引物:5'-CAGCCAGGCCAAGATTCG-3'，下游引物:5'-CAGCCCCAGTCCCTGAATT-3'，探针序列:5'-AGGAACAAGCTATTGCTGGTGGCCTCTG-3'。OX40、OX40L引物及探针序列为美国Applied Biosystems公司产品。预实验PCR扩增阳性产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的条带。用回收试剂盒回收纯化后，用OD260测定值和片段长度数据换算出浓度(拷贝/μL)，再做梯度稀释，制备成定量PCR阳性定量标准品，荧光定量阴性物采用灭菌双蒸水。PCR反应条件:50℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，两组间比较采用独立样本资料t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验;OX40 mRNA表达水平与SLEDAI相关性分析采用Spearman检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组OX40、OX40L mRNA在外周血单个核细胞中的表达 SLE组外周血单个核细胞OX40 mRNA水平显著高于对照组(P＜0.05)，活动期SLE患者外周血单个核细胞OX40 mRNA水平显著高于非活动期患者和对照组(P＜0.05或＜0.01)。活动期SLE患者组OX40L mRNA水平显著高于非活动期患者和对照组(P ＜0.05或 ＜0.01)。见表1。

表1 各组OX40、OX40L mRNA在外周血单个核细胞中表达(拷贝/μL，¯x ±s)

2.2 OX40、OX40L mRNA 表达水平与 SLEDAI的关系 Spearman相关分析显示，OX40 mRNA表达水平与 SLEDAI呈正相关(r=0.35，P ＜0.05)，而 OX40L mRNA表达水平与SLEDAI无关(P＞0.05)。

3 讨论

SLE是一种慢性自身免疫性疾病，属于风湿性疾病中的弥漫性结缔组织病。它可引起全身多个脏器受累，包括皮肤、关节、肾脏、神经系统、血液、浆膜、呼吸和心脏等系统［3］。迄今为止，SLE仍无法根治。但是，随着早期诊断手段的增多和治疗水平的提高，SLE预后明显改善，SLE的发病机理已经逐渐被人们熟知。

研究显示，免疫系统调控功能异常在SLE发病过程中具有重要作用，可造成SLE患者系统性病理损害，并引起一系列临床症状。其中，共刺激分子异常表达在自身免疫性疾病的形成和发展中具有重要的促进作用，OX40、OX40L即是其中重要的共刺激分子。OX40属于肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体家族，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量约为50 kD。OX40是一个T细胞活化蛋白，只表达于活化的T细胞表面，且主要在细胞，部分细胞也表达。OX40L是OX40的配体，属于肿瘤坏死因子(TNF)家族，是Ⅱ型跨膜蛋白，分子量约为34 kD，OX40L也只在活化的抗原提呈细胞上表达。OX40、OX40L在T细胞的活化、增殖、迁移以及生发中心的形成和DC的分化成熟过程中起重要作用［4］。Farres等［2］研究表明，SLE 患者 OX40+T 细胞百分数显著高于健康体检者，这种细胞在肾炎型SLE患者外周血中数量增加的更为显著。尽管与健康体检者相比，SLE患者外周血OX40+T细胞的绝对数相差无几，但是SLE患者表达OX40 T细胞的百分率显著高于健康体检者，且与SLE的疾病活动程度密切相关。Manku等［5］证实了OX40在SLE患者的表达，且肾炎型SLE患者的T细胞上OX40的聚焦程度显著高于非肾炎型SLE患者。Dolff等［6］研究发现，SLE患者OX40表达水平高于健康体检者，狼疮肾炎患者OX40表达水平也高于健康体检者，且肾活检发现OX40+T细胞浸润。近年研究还发现，OX40L能协同刺激T细胞的活化，促进B细胞产生高效价抗体，介导OX40+T细胞向炎症部位浸润［7］;同时OX40/OX40L在脂多糖等危险信号刺激下，与细胞质内信号传导分子肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)-2、TRAF-3、TRAF-5 结合，上调核因子(NF)-κB的活性，使 Bcl-2、Bcl-xL等一系列抗凋亡分子高表达来抑制细胞凋亡，继而维持CD+4T细胞的存活，促进CD+4T细胞穿过血管内皮在炎症位点募集［8］，从而打破自身耐受参与SLE的发病。这些研究结果均表明，OX40、OX40L与SLE的发病密切相关。

本研究结果显示，活动期SLE患者外周血单个核细胞OX40、OX40L mRNA表达水平较非活动期SLE患者与健康体检者明显升高;OX40 mRNA表达水平与SLEDAI呈正相关。提示共刺激分子OX40变化与SLE疾病的活动性呈一定相关性，其可能在SLE的发病机制及病情进展中起作用。

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［4］Humphreys IR，Loewendorf A，de Trez C，et al.OX40 costimulation promotes persistence of cytomegalovirus-specific CD8 T cells:a CD4-dependent mechanism［J］.J Immunol，2007，179(4):2195-2202.

［5］Manku H，Graham DS，Vyse TJ.Association of the co-stimulator OX40L with systemic lupus erythematosus［J］.J Mol Med(Berl)，2009，87(3):229-234.

［6］Dolff S，Quandt D，Wilde B，et al.Increased expression of costimulatory markers CD134 and CD80 on interleukin-17 producing T cells in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Res T-her，2010，12(4):R150.

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