三疣梭子蟹微卫星标记的筛选及特征分析

相 瑜，任丽平，王日昕

（浙江海洋学院海洋科学学院，浙江舟山 316022）

三疣梭子蟹Portunus trituberculatus，属于软甲纲、十足目、梭子蟹科，分布于日本、朝鲜、马来群岛、红海以及中国的广西、广东、福建、浙江、山东半岛、渤海湾、辽东半岛等地，生活环境为海水，常生活于10～30 m的沙泥或沙质海底。三疣梭子蟹肉多，脂膏肥满，味鲜美，营养丰富。每百克蟹内含蛋白质14 g、脂肪2.6 g。鲜食以蒸食为主，还可盐渍加工“枪蟹”、蟹酱，蟹卵经漂洗晒干即成为“蟹籽”，均是海味品中之上品。

由于三疣梭子蟹具有生长快、环境适应能力、强市场价格高和国内外价格稳定等特点使得各地三疣梭子蟹养殖不断升温，现已成继对虾、青蟹后又一重要养殖品种并被列为我国海洋水产养殖的重点对象[1-4]，取得了良好的社会和经济效益。根据养殖设施的不同,梭子蟹养殖有池塘养殖、滩涂围栏养殖、水泥池养殖和海区笼养等几种方式。然而在养殖过程中出现诸多病虫害如病毒病、真菌饼、寄生虫类病以及养殖环境的恶化引起的各种养殖问题，关于三疣梭子蟹的种质资源分析与评估的研究已经开展，这些研究将为筛选及培育具有优势生长性状、抗病能力强、抗性良好的优良品种，保持三疣梭子蟹养殖业持续健康发展提供遗传种质依据。

微卫星因为具有在基因组中广泛分布、易于检测等特性，因此微卫星分子标记技术在种质遗传以及保护生物学领域得到了广泛的应用。微卫星DNA(Microsatellite DNA)是指以少数几个核苷酸(1～6个)为单位多次重复的简单序列，因而也被称为简单序列重复(simple sequence repeats,SSR)[5]。因等位基因突变快、多态性高、杂合度高、信息含量丰富和呈孟德尔共显性等显著优点[6]，微卫星分子标记技术已经广泛应用于例如人类、灵长类动物、农作物等连锁群的构建和物理图谱的绘制[7-9]。

目前，相关的分子标记技术已经被应用于三疣梭子蟹的种质资源保护的研究当中。微卫星标记也已经被应用到了三疣梭子蟹的资源保护领域，并在其种群遗传结构分析等方面进行了相关应用[10-12]。但由于目前筛选得到的关于三疣梭子蟹的SSR标记的数量比较少，微卫星标记的缺乏已经对三疣梭子蟹的种质资源保护、遗传图谱构建及遗传性状等相关研究造成了障碍。为获得大量的SSR分子标记，突破三疣梭子蟹相关遗传和资源保护领域的研究瓶颈，本文利用5’锚定引物法筛选开发了一批新的微卫星标记，这样既丰富了三疣梭子蟹的分子标记资源，也为进一步的三疣梭子蟹辅助育种提供必要的遗传学理论支持。

1 材料和方法

1.1 基因组DNA提取

实验所需三疣梭子蟹样品采自舟山东门水产品市场。取两只三疣梭子蟹腿部肌肉于1.5 mL离心管中，加入 300 μL 裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl，1%SDS，pH 8.0)，将管足组织于离心管中充分剪碎，加入25 mg/ml蛋白酶K 10 μL，55℃水浴直到组织完全溶解。稍微冷却后，加入300 μL饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混匀，10 000 r/min离心10 min;取上清，重复抽提3次至上清液澄清；上清液中加入2倍体积的冰乙醇沉淀30 min。10 000 r/min离心10 min后用75%乙醇清洗2次，室温晾干后溶于50 μl TE溶液，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质量后于-20℃保存备用。

1.2 5’锚定引物扩增

实验所用引物序列为P(CT)6=KKVRVRV(CT)6，K=G/T,V=G/C/A,R=G/A。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

将提取的2只三疣梭子蟹样个体的DNA等体积混合作为模板，直接用锚定引物PCR扩增，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测，利用TIANquick Midi Purification Kit试剂盒将300～1 000 bp大小的扩增片段回收纯化，回收步骤参照试剂盒说明书。建立25 μL的PCR反应体系，其中包含1 μL混合DNA模板，1.5 μL 锚定引物，1.2 μL dNTP，1×buffer，1 U Taq酶。PCR 反应程序设定为：95 ℃预变性 5 min,然后95 ℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，7个循环；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；最终延伸10 min。

1.3 克隆及测序

建立 10 μL 的连接体系，包括 5 μL Solution I，4.5 μL 纯化后的 PCR 产物，0.5 μL 的 pMD19-T vector(Takara)，16℃连接过夜。然后用DH5α大肠杆菌感受态细胞进行转化，根据蓝白斑筛选原则挑取平板上的单个菌落扩大培养。

利用M13系列通用引物对菌液进行阳性检测，10 μL的PCR体系包含1 μL菌液，M13上下游引物各10 pM。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，随机挑选300 bp以上的克隆子送到南京金斯瑞生物科技公司测序。

1.4 序列分析及统计

测序结果用Chromas软件进行峰图分析，DNAMAN去除重复序列，按照如下参数：一、二、三、四、五核苷酸，最低重复次数分别为12、6、3、3、3、3次，典型的双核苷酸微卫星核心序列的最小长度为12 bp，以此标准搜索微卫星位点并进行统计。

2 结果

2.1 扩增条件筛选

锚定引物PCT分别在49℃、52℃、55℃、58℃四个退火温度下进行扩增，结果显示PCT引物在三疣梭子蟹基因组中55℃退火温度下扩增效果最佳，凝胶电泳检测结果如图1所示。

2.2 序列分析及统计结果

对41个克隆子进行测序，其中35条序列含有微卫星位点，阳性克隆比率达到85.4%。去除重复序列后进行微卫星搜索并进行分类统计见表1，结果显示共检测到55个微卫星位点，分布于20条序列中，其中19条序列检测到2个或2个以上微卫星位点。

在获得的55个微卫星位点中，核心序列为(CT/AG)的微卫星位点有27个(50%)，除此之外还包含27个其他类型重复的微卫星(50%)，27个中多为三碱基或者4碱基重复，重复次数在3以上。对这些微卫星位点的重复类型进行统计，其统计结果如图2所示。

图1 PCT引物在三疣梭子蟹基因组中的扩增结果Fig.1 PCR profiles produced from genomic DNA.泳道 1为marker，泳道 2-5分别为49℃、52℃、55℃、58℃四个退火温度下的扩增结果

表1 微卫星位点的搜索及统计结果Tab.1 Searching and statistics of microsatellite site

按照WEBER[13]提出的分类标准，微卫星可以分为三种类型即：P型、I型、C型。P型（完美型perfect)指没有中断的或附近无其它重复序列的重复序列，I型（非完美型imperfect)指2个或2个以上的同种重复序列，被3个碱基以下的非重复序列所间隔，C型（混合型compound)指一种重复序列与其它种类的重复序列被3个碱基以下的非重复序列所间隔。根据此分类标准，对该实验中检测到的微卫星位点进行位点特征分析，结果显示：有2个位点属于非完美型(3.70%)，未曾出现复合型，结果显示见表2。

3 讨论

图2 微卫星标记的重复类型Fig.2 Repeat type of microsatellite markers I为非完美型微卫星位点

表2 微卫星序列的特征统计Tab.2 Characteristics Statistics of microsatellite markers

三疣梭子蟹由于其丰富的营养价值以及其味鲜等特性，已经逐渐成为水产养殖业重要的养殖对象。目前，三疣梭子蟹大规模人工养殖已经在中国沿海地区广泛展开。由于三疣梭子蟹人工养殖亲本主要来源于天然海捕亲蟹,并未培育出适于人工养殖的新品种或新品系,因而近几年在三疣梭子蟹人工养殖过程中频频出现诸如病害频发、抗逆性差、性早熟等现象,严重制约了三疣梭子蟹人工养殖的健康发展[14-15]，这就促使广大科研工作者要对三疣梭子蟹种质资源现状开展研究分析。在分子标记研究方面，三疣梭子蟹的线粒体基因组已经获得[16]，另外，一些学者也开发了一系列的微卫星分子标记并应用于亲子鉴定及资源研究中[17-19]。

微卫星DNA首先由SKINNER等[20]在寄居蟹中发现，因其位点数量多、多态信息含量高、高重复性、孟德尔共显性方式遗传及检测快速等优点被广泛应用于遗传学研究中。在微卫星标记的引物设计中微卫星序列的选取是关键的一步。目前得到微卫星序列的主要途径主要有两种即：一是通过构建富含微卫星的基因组文库，进而杂交筛选出含有微卫星序列的阳性克隆，通过测序得到含有微卫星DNA的的片段序列；二是省略构建文库，直接从数据库中利用微卫星搜索软件筛选含有微卫星DNA的序列信息，或是利用近缘物种的已知位点，这种方法省时有效，但受限于数据库的资源量。构建文库的方法中，普遍被使用的有FACSO方法和5’锚定法。5’锚定引物法是由FISHER等[21]发明，因高效率及快速等优点，被广泛用于筛选微卫星标记。该方法是在一段少量重复序列的5’端添加几个简并碱基构成锚定引物，扩增两个相邻的特定微卫星位点及其之间的序列。5’锚定引物法有几大优点：首先是避了免获得的微卫星重复区域的侧翼序列过短而导致不能用来设计特异引物；其次是可用于构建富含某特定位点的微卫星文库；然后是在扩增特定位点的同时，可能会获得其他类型的位点，因此每测一条序列即可获得至少2个微卫星位点，具有较高的筛选效率。

BRENNER等[22]的研究表明，(CT)n类型的微卫星序列在动物个体中含量丰富，仅次于(CA)n重复，结合刘媛等[23]分析三疣梭子蟹EST序列微卫星分布的研究结果，本实验采用PCT锚定引物，(CT)6的5’端加有简并碱基KKVRVRV，其中VRVRV形成封闭，防止在扩增是引物在GA重复上发生滑动，确保扩增的多态的真实性。PCT锚定引物扩增的是相邻的CT和AG重复类型的微卫星及其之间的序列。测序后得到的35条序列中，核心序列为(CT/AG)重复的微卫星有27个，占筛选总数的50%。该试验采取锚定的方法，得到的（CT/AG）的重复类型的微卫星位点在所有的位点中数量上占绝对的优势。因此从实验结果可以看出，该锚定方法筛选三疣梭子蟹(CT/AG)类型的微卫星位点较成功。而且从微卫星类型上可以看出，三疣梭子蟹的微卫星类型很丰富，这也为接下来三疣梭子蟹的研究提供一定的理论依据。

本研究筛选的这些微卫星标记为三疣梭子蟹构建连锁群及遗传图谱，开展种群遗传结构分析，并对品种选育和种系评估提供了可靠的分子标记，也为进一步研究三疣梭子蟹的群体遗传多样性和群体结构打下坚实的理论基础。

[1]薛俊增,堵南山,赖 伟.中国三疣梭子蟹Portunus trituberculatus Miers的研究[J].东海海洋,1997,15(4):60-65.

[2]史会来,金翀略,林桂装,等.浙江三疣梭子蟹养殖现状[J].河北渔业,2010(7):39-41.

[3]程国宝,史会来,楼 宝,等.三疣梭子蟹生物学特性及繁养殖现状[J].河北渔业,2012(4):59-61.

[4]钱丽君,张德民,徐小红.应用DGGE分析三疣梭子蟹养殖塘底泥细菌的多样性[J].水产学报,2007,31(2):204-210.

[5]HAMADA H,PETRINO M G,KAKUNAGA T.A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1982,79(7):6 465-6 469.

[6]TOTH G,GASPARI Z,JURKA J.Microsatellites in different eukaryotic genomes:survey and analysis[J].Genome Research,2000,10:967-981.

[7]MCCOUCH S R,CHEN X,PANAUD O,et al.Microsatellite marker development,mapping and applications in rice genetics and breeding[J].Plant Mol Biol,1997,35:89-99.

[8]孙效文,张晓锋.水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用[J].中国水产科学,2008,15(4):689-703.

[9]SUN D Q,SHI G,LIU X Z,et al.Genetic diversity and population structure of the marbled rockfish,Sebastiscus marmoratus,revealed by SSR markers[J].Journal of Genetics,2010,90(1):21-24.

[10]李晓萍,刘 萍,宋协法.三疣梭子蟹微卫星富集文库的构建与群体遗传分析[J].中国水产科学,2011,18(1):194-201.

[11]宋来鹏,刘 萍,李 健,等.三疣梭子蟹基因组小卫星特征分析[J].水产学报,2008,32(6):838-846.

[12]迟大利,阎斌伦,高 焕,等.三疣梭子蟹分子生物学研究进展[J].水产养殖,2008,29(4):11-15.

[13]WEBER J L.Informativenes of human(dC-dA)n(dG-dT)n polymorphisms[J].Genomics,1990,7:524-530.

[14]艾春香,林琼武,李少菁,等.蟹类的营养需求研究及其配合饲料研制[J].厦门大学学报:自然科学版,2006,45(Z2):205-212.

[15]王国良,金 珊,李 政,等.三疣梭子蟹养殖群体同工酶的组织特异性及生化遗传分析[J].台湾海峡,2005,24(4):475-480.

[16]邢晶晶.分子遗传标记及其技术在水产生物中的研究与应用[J].水产学杂志,2002,15(1):61-70.

[17]王建平,余晓巍,沈庞幼.三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)微卫星位点的分离和序列分析[J].海洋与湖沼,2009,40(1):83-86.

[18]刘 磊,李 健,刘 萍,等.微卫星DNA标记用于三疣梭子蟹家系亲子关系的鉴定[J].渔业科学进展,2010,31(5):76-82.

[19]任宪云,刘 萍,李 健,等.三疣梭子蟹微卫星多重PCR技术建立及条件的优化[J].渔业科学进展.2011,32(3):76-83.

[20]SKINNER D M,BETTIE W G,BLATTNER F R.The repeat sequence of a hemit crab satellite deoxyribonucleic acid(TACG)n×(ATCC)n[J].Biochemistry,1974,13:3 930-3 937.

[21]FISHER P J,GARDNER R C,RICHARDSON T E.Single locus microsatellites isolated using 5'anchored PCR[J].Nucl Acids Res,1996,24:4 369-4 371.

[22]BRENNER S,ELGAR G,SANFORD R,et al.Characterization of the pufferfish(Fugu)genome as a compact model vertebrate genome[J].Nature,1993,366:265-268.

[23]刘 媛.三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究[D].青岛:中国科学院海洋研究所,2011.