研究青霉素结合蛋白测定技术

梁玉

【摘 要】当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难，对β-内酰胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白（PBPs）改变造成的耐药性，是β-内酰胺类抗生素的特点。

【关键词】氘标记 青霉素结合蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳 荧光放射自显影

【中图分类号】R515【文献标识码】A【文章编号】1672-5158（2013）02-0334-01

当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难，对β-内酰胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白（PBPs）改变造成的耐药性，是β-内酰胺类抗生素的特点。PBPs为细菌的胞浆膜上的一些膜蛋白，是参与细菌细胞壁肽聚糖生物合成的霉。β-内酰胺类抗生素正是通过与PBPS结合，抑制细菌细胞壁的合成引起细菌细胞死亡从而发挥杀菌作用。PBPs的数目、位置、亲和力的变化造成与PBPs类抗生素不易结合而产生耐药性。人们常采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影的方法研究PBPs图谱，以便了解敏感菌和耐药菌的区别。PBPs测定技术是研究β-内酰胺类耐药性的重要手段。一般放射自显影法的穿透力弱，不能获得PBPs图谱。要获得获得PBPs图谱需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”。国内有关PBps测定技术报道甚少，以3H标记者更少，本文介绍这一技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种肺炎链球菌31003，30301（北京药品生物制品检定所； Pen08.R6本室保存菌种。

1.1.2 培养基C+Y培养基，参见文献。

1.1.3 仪器及药品

垂直板凝胶电泳槽（吴县科研仪器厂）；NG-l型真空凝胶干燥器（太仓电视机厂）；TGLL-1a型台式高速冷冻离心机（中科院上海生物化学研究所）；8438-超低温冰箱（FormaSclentifi。美国）；电泳仪DY-1型（上海医用分析仪器厂）；丙烯酰胺（Aerylamide，临海止学厂产）；甲撑双丙烯酰胺.（big；瑞士产品）；N，N，N，N一四甲基乙二胺（TEMED，上海前进农场制剂厂）；3H标记青霉素乙酰呱陡盐（NewEngiandNuclear，美国）；x光底片（天津感光材料厂；KodakDiangnostiefilmX-OmatAR13X18em）；2，5-二苯基嗯哇（PPO，闪烁纯，上海试剂一厂）；月桂酰肌氨酸钠（Sarkosyl，Sigma）；十二烷基硫酸钠（SDs，上海新华化工厂）；二甲基亚矾（DMso，北京旭东化工厂）。

1.2 方法

1.2.1 肺炎链球菌PBPs样品的制备：将肺炎链球菌接种c+Y培养基，37℃过夜培养。次日移种新鲜培养基中，37℃培养2～3h至对数生长期。菌液分装试管，每管lml，于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素，37℃保温10min。在冰浴中加入5ml非标记青霉素G钠盐20万单位/ml， 5000转/min冷冻离心，弃去上清，菌体沉淀用50ml磷酸缓冲液（PH6.8）做成菌悬液。然后加入5～10ml20%月桂酰肌氨酸钠，37℃保温10min使细胞溶解。煮沸3min，置室温备用。

1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法。凝胶薄片的制备（厚0.2cm），凝胶配方：分离胶（10%）：Aerylamide：bis（30：0.5）6.7ml，Tris（pH8.8，1.5ml/L）5ml，10%SDS 0.2ml，蒸馏水8.1ml，真空搅拌10～15min除去气体，再加入TEMED。浓缩胶（5%）：按上述配方依次为1.7ml，2.5ml，0.1ml，5.6ml。先配制分离胶，灌注直立式电泳槽后，使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶，放入加样梳，静置2h。在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流，第一小时维持电压在60V，至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处，调高电压至120V，走完全程约需3～4h，用考马斯蓝R250染色30～45min，过夜脱色。

1.2.3 荧光放射自显影法：凝胶片用二甲基亚矾（DMSo）处理30min，再用新鲜DMSo再次处理30min，再用20%2，5-二苯基嗯哇处理2～3h，l%甘油和1%乙酸处理lh，将凝胶片贴附在厚滤纸上，使用凝胶真空干燥器进行真空干燥。将凝胶片和x光底片贴紧，置于x光射线暗匣内，置超低温冰箱中-70℃使曝光1～2wr，将x光底片显影，定影，冲洗得到PBPs的放射自显影图谱。x光底片预曝光条件：（1）国产x光底片用照相闪光灯红色滤光片，加6层红色玻璃纸滤过，x光底片上覆盖6层红色玻璃纸，距离50cm，闪光灯闪二次；（2）进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA40kV，距离40cm，每张x光底片曝光0.04s。

1.2.4 竞争性结合试验：定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林，37℃保温10min，然后加入饱和量的3H标记青霉素，37℃保温10min，再按上述方法继续进行实验。

2 结果与讨论

本法测定肺炎链球菌全细胞中PBPs的含量，首先需要分离菌体蛋白，为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上，必须控制菌龄和菌液浓度。肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜，它能选择性地作用于胞浆膜，使胞浆膜破裂，菌体蛋白释放出来，与此同时，已经与青霉素结合的膜蛋白PBPs也一起释放出来。样品制备完毕，煮沸3min，以便除去某些蛋白质的干扰，青霉素与PBPs结合较牢固，不会被破坏。

本实验采用SDS-PAGE方法（4-5），SDS在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为0.1%。分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。

3H标记物穿透力较弱，用一般放射自显影方法不能得出图像，本实验采用荧光放射自显影法（6-8）（Fluoro，aphy），检测聚丙烯酰胺凝胶片上3H标记的蛋白质，有一定的优点。PPO是荧光增效剂，其作用原理不是直接依赖3H放射出来的射线，而是藉助3H上的粒子与PPO相互作用发射出的光，造成x光底片的局部发黑得到深浅不同的暗线，从而获得青霉素结合蛋白的图谱。肺炎链球菌的PBPs图谱上可见有三条区带，即PBP1 （a、b）， PBP2和PBP3。一般情况下，青霉素浓度越大，亲和力越强，颜色越深，在竞争性试验中，甲氧西林浓度越大，亲和力越强，颜色越浅。

据报道（7-9），x光底片预曝光可增加荧光放射自显影法的灵敏度，因为预曝光可以纠正样品放射性和x光底片图像吸收值之间的非线性关系。所以，经预曝光的x光底片上所得到的图像可以正确反映出样品的放射性分布情况。

用国产x光底片不经预曝光时，无图像出现，经预曝光则有图像出现，用进口x光底片未经预曝光者，图像的暗线区别不大。预曝光后的x光底片显示出暗线深浅不同的正确图像。国产x光底片与进口x光底片比较，国产片敏感性较低，预曝光后的x光底片上出现的暗线普遍较浅且细，PBP1不可见。

参考文献

[1] 钱海伦.细菌对卜内酰胺类抗生素耐药性的研究进展.中国药科大学学报，2007；20（3）：188

[2] 钱海伦，李静.肺炎球菌生长培养基和菌种保存方法的研究.徽生物学通报，2009；16（l）：15

[3] 王苏生，舒群芳，周芬凝胶中同位素测定的快速荧光自显影方法.生物化学与生物物理进展，2006；6：66