血小板制品细菌污染的革兰阴性菌脂多糖检测方法评价

周晓红

研究表明，除HIV、HBV和HCV等病毒外，血液制品的细菌污染也是输血相关的发病和死亡的重要因素，而血小板因其需要室温保存，同时储存时不断摇动，血小板中丰富的营养也利于细菌生长，一旦被污染，细菌就会很快在其中繁殖。使血小板细菌污染成为导致脓毒血症输血反应最常见的原因。目前血小板制品细菌污染问题已引起各国的重视，国外的一些血液中心已经将血小板制品的细菌污染检测纳入到常规检测项目，主要应用BacT/Alert全自动细菌培养仪检测血小板的细菌污染情况［1］。但由于该方法检测时间长、成本高、灵敏度低，对某些细菌会产生漏检等缺点，限制其在血液样本大规模筛查中得应用。

针对革兰氏阴性菌脂多糖检测，由于其快速、灵敏、特异等优点，使得血小板制品细菌污染的快速检测成为可能。目前该检测方法有一定的局限性，只能检测革兰氏阴性菌脂多糖，不能区分细菌种属，而革兰氏阳性菌肽聚糖的检测需MB-80V型检测系统。

1 资料与方法

1.1 一般资料 100份血小板样本均来源于本站2011年11月至2012年11月无偿献血者捐献的单采血小板，样本经BacT/Alert全自动细菌培养仪检测，确定为阴性。阴性组:随机抽取68份样本作为阴性对照;阳性组:随机抽取32份样本，接入浓度为10CFU/ml的菌悬液作为阳性样本;将上述100份样本用MB-80E细菌内毒素检测系统检测。

1.2 试剂与仪器 革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒(北京金山川科技发展有限公司)、MB-80E微生物快速动态检测系统;BacT/AlertBPA需氧培养瓶(美国梅里埃公司)、BacT/AlertBPN厌氧培养瓶(美国梅里埃公司)、BacT/Alert全自动细菌培养仪。

1.3 方法

1.3.1 在无菌条件下取血小板0.1 ml，加入装有0.9 ml样品处理液中，混匀后70℃保温10 min，取出后立刻放入冰水浴中，即为待测样品。取待测血浆0.2 ml直接加入酶反应主剂中，溶解后使用微量加样器转移至10×75 mm标准玻璃反应管中，插入MB-80E微生物快速动态检测系统中进行反应，反应结束后自动计算出待测样品中革兰阴性菌脂多糖含量。

1.3.2 单采血小板制品采集24 h候取样，充分混匀后挤压到转移袋约5～10 ml，封闭热合。在无菌条件下用一次性无菌注射器抽取转移袋中血小板制品，接种到1瓶需氧培养瓶，1瓶厌氧培养瓶，将培养瓶放入全自动细菌培养仪中，每天观察结果。

2 结果

见表1。

表1

3 讨论

68份血小板阴性标本检测结果细菌内毒素含量在1～4pg/ml之间，32份血小板阳性标本细菌内毒素含量在20.0～50.0pg/ml之间，并且BacT/Alert全自动细菌培养仪32份血小板阳性标本菌在24 h内出现阳性结果。细菌内毒素检测10 pg/ml以下结果为正常，20 pg/ml以上为革兰阴性菌感染有临床意义。

由于缺少一种简便、灵敏、特异、经济的检测体系，我国大部分采供血机构未将血液制品的细菌污染检测纳入常规检测项目。另外在细菌污染研究中普遍采用规定时限内初始细菌培养结果阴性即可发放的原则，因此，存在超过时限外出现阳性结果而血小板已经发放并输注的可能性。血小板制品细菌污染率和临床输血反应率的差异提示，一方面，低水平的细菌污染不能引起临床表现;另一方面，由于大多数血小板制品使用给肿瘤、血液病和骨髓移植等免疫功能抑制的患者，特别是儿童患者，这些患者疾病的严重性和使用血小板制品时机选择的不同，使其表现的脓毒血症，甚至是脓毒性休克和死亡等临床事件常常未能和输入细菌污染的血小板制品关联。使用MB-80E细菌内毒素检测系统检测血小板制品，该法灵敏度高、特异性好，与BacT/Alert全自动细菌培养仪相比，耗时少，检测反应时间为3600 s，且成本低。通过对100份单采血小板标本用MB-80E微生物快速动态检测系统和BacT/Alert全自动细菌培养仪同时检测，结果一致，表明MB-80E微生物快速动态检测系统可用于血液制品细菌污染的常规检测。特别是BacT/Alert全自动细菌培养仪，系统有效检测细菌生长的灵敏度为1～10CFUs/mL，在抽样时，由于血袋内细菌浓度过低，造成或抽样中活菌极少，或抽样中没有细菌。而产生阴性的培养结果［1］。而革兰阴性菌脂多糖检测原理是革兰氏阴性菌脂多糖激活酶反应主剂中得相应因子后形成凝固蛋白，根据其引起的浊度变化对革兰氏阴性菌脂多糖浓度进行定量。

［1］Brecher ME，Hay SN Bacterial contamination of blood components.Clin Miccrobiol，18(1).