高效液相色谱法测定植物油中苯并(α)芘测量不确定度评定

罗成玉

（上海市浦东新区计量质量检测所，上海 201201）

高效液相色谱法测定植物油中苯并(α)芘测量不确定度评定

罗成玉

（上海市浦东新区计量质量检测所，上海 201201）

按照GB/T 22509-2008利用反相高效液相色谱法对植物油中苯并(α)芘含量进行分析，建立数学模型，对测量结果的不确定度来源如标准物质、校准工作曲线、样品处理、回收率等各不确定度分量进行分析评定及量化。按数学模型计算得植物油中苯并(α)芘含量为2.06 μg/kg时，扩展不确定度为0.05 μg/kg，结果表达式为（2.06±0.05）μg/kg（k=2）。

高效液相色谱；植物油；苯并(α)芘；不确定度

苯并(α)芘是一种强致癌化合物，被国际癌症研究中心列为2A类致癌物，会对人体健康造成潜在威胁。人体中的苯并(α)芘从食物中的摄入量高于从空气和饮用水中的摄入量，而从食用油中的摄入量占食物中摄入量的1/3［1］。GB 2716-2005［2］规定，食用植物油类产品中苯并(α)芘的安全限量为不超过10 μg/kg。

目前，苯并(α)芘的检测方法有荧光分光光度法［3］、液相色谱-紫外检测器法［4］、液相色谱-荧光检测器法［5-7］等。

测量不确定度在实验室间比对、测量临界值的判断、方法的确认及检测工作国际化等方面具有重要意义。根据JJF 1059-1999［8］的要求，笔者对高效液相色谱法测定植物油中苯并(α)芘含量的测量结果进行了不确定度评定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1100型，配荧光检测器，美国安捷伦公司；

中性氧化铝小柱；

乙腈、甲苯、四氢呋喃：均为色谱纯。

1.2 色谱条件

色谱柱：多环芳烃分析柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈-水（体积比为88∶12），流速为1.0 mL/min；荧光检测器：发射波长为406 nm，激发波长为384 nm。

1.3 溶液配制

苯并(α)芘标准溶液：精确称取12.5 mg苯并(α)芘标准样品于25 mL容量瓶中，用甲苯溶解，定容。分别用甲苯稀释成系列浓度的标准溶液，用以绘制标准工作曲线。

样品溶液：称取约0.4 g植物油样品，用2 mL石油醚溶解稀释。将稀释液过层析柱，向层析柱中加入20 mL石油醚，洗脱，洗脱速度为1 mL/min，收集洗脱液。将洗脱液在65℃的水浴中旋转蒸发至1 mL，转移至样品瓶中，于35℃下氮吹至干，注入100μL乙腈四氢呋喃混合溶液，涡旋溶解，待测。

2 数学模型

样品中苯并(α)芘含量测定采用外标法定量，结果计算公式为：

式中：X——样品中苯并(α)芘含量，μg/kg；

c——利用标准曲线得到的待测液中苯并(α)芘的浓度，ng/μL；

V——待测液体积，μL；

frec——回收率校正因子，等于回收率的倒数；

m——样品质量，g。

3 不确定度的主要来源

3.1 利用标准曲线得出试样中苯并(α)芘的浓度引入的不确定度

包括标准样品引入的不确定度，标准工作液配制时玻璃仪器校准引入的不确定度、温度变化引入的不确定度及标准曲线拟合引入的不确定度。

3.2 样品称量引入的不确定度

由天平的最大允许误差引起。

3.3 体积引入的不确定度

由定容体积和进样体积的不确定度组成。

3.4 样品处理过程引入的不确定度

测试样品的制备过程非常复杂，需经过均质、溶液转移、过滤、固相萃取等步骤，每一步操作都会引入不确定度，要采用检测方法确认的有关数据，如回收率对制样过程引入的不确定度进行评定。

4 不确定度分量的评定

4.1 由标准曲线求得试样中苯并(α)芘的浓度引入的相对标准不确定度

4.1.1 标准样品纯度引入的不确定度

在苯并(α)芘标准样品证书上查得其纯度为(99.6±0.5)%。在95%置信区间内，包含因子k=2。由苯并(α)芘纯度引入的相对标准不确定度：

4.1.2 标准物质称量引入的不确定度

用精确至0.1 mg的电子分析天平称取苯并(α)芘标准样品，称量过程所引入的不确定度来自天平校准。天平校准的允许误差极值为±0.1 mg，按正态分布，容量因子k=2，称样量为12.5 mg，则称量标准样品时天平引入的相对标准不确定度：

4.1.3 玻璃量具引入的不确定度

根据JJG 196-2006［9］，1 mL A级分度吸量管允许最大误差为±0.008 mL，按均匀分布，k=，则1 mL A级分度吸量管引入的相对标准不确定度［10］：

同理，查JJG 196-2006得，5 mL A级分度吸量管允许最大误差为±0.025 mL；10，25，100 mL A级单标容量瓶的允许误差分别为±0.020，±0.030， ±0.10 mL。以上各量按均匀分布，k=，则各量引入的相对标准不确定度：

将以上数据合成，得玻璃量具引入的相对标准不确定度：

4.1.4 温度变化引入的不确定度

实验室的温度波动范围一般为±3℃，水体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，玻璃的膨胀系数为9.75×10-6/℃（可忽略不计）。计算标准不确定度时按照均匀分布，k=，各吸量管及容量瓶因温度变化引入的不确定度列于表1。

表1 温度变化引入的不确定度

将表1中数据合成，得温度变化引入的相对标准不确定度：

4.1.5 标准曲线拟合引入的不确定度

用液相色谱仪分别测定5种浓度的苯并(α)芘标准溶液，每种浓度测3次，得到相应的峰面积A，测定结果见表2。实验数据用最小二乘法进行拟合，得到直线方程y=a+bx，a为截距，b为斜率。

表2 最小二乘法拟合标准溶液浓度—峰面积结果

由表2数据计算得：b=1 095.559，a=0.739。标准曲线的标准偏差s=0.731 7。

对被测样品测量两次，由下式［8］计算得苯并(α)芘浓度x0的标准偏差估计值s(x0)=5.037×10-5：

由标准曲线计算得被测样品浓度的相对标准不确定度：

则由标准曲线计算得试样中苯并(α)芘的浓度引入的相对标准不确定度：

4.2 样品称量引入的不确定度

同4.1.2，用感量为0.1 mg的电子分析天平称取0.4 g植物油样品，称量引入的相对标准不确定度：

4.3 样品处理液定容引入的不确定度

根据JJG 196-2006，0.1 mL A级分度吸量管允许最大误差为±0.002 mL，按均匀分布，k=，则0.1 mL A级分度吸量管的相对标准不确定度：

如表1，温度变化引入的相对标准不确定度：u17=3.64×10-4，则样品处理液定容引入的相对标准不确定度：。 4.4 试样均匀性和处理操作过程引入的不确定度

测量重复性主要受实验人员在样品处理过程中的操作一致性、样品均匀性和仪器性能的影响，该不确定度属A类评定，利用添加2.20 μg/kg水平10次样品回收率测定结果（见表3）进行计算，标准不确定度采用平均值的标准偏差进行评定。

样品处理过程引入的不确定度为：

表3 植物油中苯并(α)芘的含量测定结果

4.5 合成标准不确定度

由上述各相对标准不确定度合成植物油中苯并(α)芘含量测定的相对标准不确定度为：

4.6 扩展标准不确定度

根据测量不确定度评定指南对一般实验室的要求［8］，在置信概率P=95%时，取k=2，植物油中苯并(α)芘含量测定结果的相对扩展不确定度为：

由实验数据的平均值计算得该植物油中苯并(α)芘含量的最佳估计值：X=2.06 μg/kg，故扩展不确定度：U95=XU95,rel=0.05 μg/kg。

4.7 测量结果报告

按照GB/T 22509-2008检测方法，当取样量为0.40 g时，植物油中苯并(α)芘的含量测定结果为（2.06±0.05）μg/kg，k=2。

5 结论

植物油中苯并(α)芘的含量测定结果的不确定度主要由标准曲线得出试样中苯并(α)芘的浓度引入的不确定度和样品处理过程引入的不确定度所引起，其次是样品定容及称量引起的不确定度。实验中通过提高仪器稳定时间、选用更高精度的量具配制标准溶液、样品处理规范操作以提高回收率、增加测定次数等，可以进一步减小测量不确定度。

［1］Ibanez R，Agudo A，Berenguer A，et al. Dietary intake of polycyclic aromatic hydrocarbons in a Spanish population［J］. J Food Protec，2005，68(10): 2 190-2 195.

［2］GB 2716-2005 食用植物油卫生标准［S］.

［3］GB/T 5009.27-2003 食品中苯并(α)芘的测定［S］.

［4］NY/T 919-2004 饲料中苯并(α)芘的测定高效液相色谱法［S］.

［5］GB/T 22509-2008 动植物油脂苯并(α)芘的测定反相高效液相色谱法［S］.

［6］SC/T 3041-2008 水产品中苯并(α)芘的测定高效液相色谱法［S］.

［7］NY/T 1666-2008 肉制品中苯并(α)芘的测定高效液相色谱法［S］

［8］JJG 1059-1999 测量不确定度评定与表示［S］.

［9］JJG 196-2006 常用玻璃量器检定规程［S］.

［10］曹志军，卢利军，高岚，等.测试实验室中测量不确定度评定［M］.长春：吉林科学技术出版社，2003: 141.

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Uncertainty Evaluation of the Determination Results of Benzo (α) pyrene in Vegetable Oils by HPLC

Luo Chengyu
（Pudong New District Institute of Metrology and Quality Inspection，Shanghai 201201，China）

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2012-12-10

AbctractAccording to GB/T 22509-2008, benzo (α) pyrene in vegetable oils was detected by HPLC method. According to the maths model, the uncertainty components were analyzed, quantified and composed, which included standard material, parameters of standard curve, the extraction of sample, recycle. By the results, the content of benzo (α) pyrene in vegetable oils was 2.06 μg/kg, the expanded uncertainty was 0.05 μg/kg, and the expression of uncertainty was (2.06±0.05) μg/kg (k=2).