早期使用三七总皂苷对大鼠脑出血炎性反应的影响

赵雪松 陈志刚 徐枝芳 高 芳

（北京中医药大学东方医院神经内科，北京，100078）

早期使用三七总皂苷对大鼠脑出血炎性反应的影响

赵雪松 陈志刚 徐枝芳 高 芳

（北京中医药大学东方医院神经内科，北京，100078）

目的：早期使用三七总皂苷对脑出血大鼠（Intracerebral Hemorrhage，ICH）脑组织病理形态和炎性反应递质细胞间黏附分子-1（Intercellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）的影响。方法：将SD大鼠随机分为假手术组、模型组和三七总皂苷组，采用胶原酶注射尾状核法制作脑出血模型，观察脑组织病理形态变化；双抗体夹心-酶联免疫吸附实验（Avidinbiotincomplex-ELISA，ABC-ELISA）观察ICH大鼠血清炎性反应递质ICAM-1和TNF -α的变化。结果：HE染色观察到炎性细胞浸润，也证实了脑出血急性期炎性反应反应较剧烈，三七总皂苷显著减轻周围脑组织水肿和神经纤维排列紊乱现象；造模7 d时，模型组血清中的ICAM-1和TNF-α含量增加，三七总皂苷用药7 d可下调ICAM-1（P＜0.05）和TNF-α。结论：三七总皂苷对脑出血后脑组织病理形态恢复正常具有促进作用，抑制ICAM-1和TNF -α的释放，可能是神经元保护的作用机制之一。

脑出血；脑组织病理；细胞间黏附分子-1；肿瘤坏死因子-α；三七总皂苷

1 实验材料

1.1 动物及分组 SD雄性大鼠，体重250～310 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司SPF／VAF级，合格证号：SCXK（京）2007-0001，实验动物随机分为假手术组、模型组和三七总皂苷组。

1.2 药物及试剂 Ⅶ型胶原酶：Sigma公司美国；三七总皂苷注射液：注射用血栓通冻干粉，购自广西梧州制药股份有限公司（批号：070911），规格：150 mg／支，使用时用0.9%生理盐水新鲜配置为10 mg／mL；0.9%生理盐水：北京双鹤药业股份有限公司（批号：0706271W），规格：500 mL∶4.5 g；水合氯醛：北京化学试剂公司（批号：050308），用生理盐水制成10%浓度；多聚甲醛：北京益利精细化学品有限公司（批号：20060712），使用时配置为4%多聚甲醛-磷酸二氢钠／氢氧化钠溶液，pH7.2～7.4；大鼠ICAM-1定量EIA试剂盒：北京环亚泰克生物医学技术有限公司；大鼠肿瘤坏死因子-α定量酶联检测试剂盒：北京环亚泰克生物医学技术有限公司。

1.3 仪器 SN-2型脑立体定位仪：Narishige Scientific Lab日本；微量进样器（0～5μL）：宁波市镇海玻璃仪器厂中国；电子天平PW-3型：上海凯士电子有

限公司中国；电子天平（32212）：上海精密科学仪器有限公司中国；石蜡切片机：Leica RM2135德国；显微镜：Olympus BX60日本；SPO-Ⅱ数码成相软件：美国；数码相机：SONY T7光学变焦3.0日本；酶标仪：DENLEY DRAGONWellscan MK：Thermo芬兰；分析软件：Ascent software for Multiskan；洗板机：Wellwash 4 MK2：Thermo芬兰；数字显示隔水式电热恒温培养箱PYXDHS：上海跃进医疗器械厂中国；离心机TGL-168（编号11-07）：上海安亭科学仪器厂中国；P200微量可调移液器（规格20～200μL）：Thermo labsystems芬兰。

2 实验方法

2.1 造模 动物用10%水合氯醛（0.4 mg／kg）腹腔麻醉，俯卧位固定在脑立体定位仪上，将头背部皮肤消毒后，切开头部正中皮肤，暴露颅骨，参照包新明《大鼠脑立体定位图谱》［1］，以大鼠前囟为“0”点，横坐标向右开3 mm，向前开1 mm，钻开颅骨，直径1 mm，将微量注射器取1μL胶原酶（含有胶原酶1U）固定于脑立位仪上，垂直向下进针5.5 mm，即尾状核部位。3 min内注完胶原酶，留针7 min，缓慢退出，用少量庆大霉素防止感染，缝合切口，分笼饲养。假手术组动物以微量进液器内不加入任何液体，余操作同胶原酶造模组。采用标准鼠饲料常规喂养，自由饮水。

2.2 给药 造模后立即ip给药1次，1次／d，连续7 d，直至取材前1 d。给药组予三七总皂苷注射液72 mg／kg（10 mg／mL），模型组和假手术组给予0.9%生理盐水7.2 mL／kg。

2.3 取材方法 各组动物分别于造模后48 h、7 d经10%水合氯醛麻醉，从深麻醉后仰卧固定，迅速剪开胸壁，暴露心脏，经心脏用150 mL生理盐水灌洗至血液冲尽，换用4%多聚甲醛-磷酸二氢钠／氢氧化钠灌注固定，灌注速度先快后慢，到大鼠四肢及尾巴伸直变硬灌注完成。断头取脑，沿注射胶原酶进针孔冠状切开，将脑组织置入4%多聚甲醛-磷酸二氢钠／氢氧化钠中固定24 h，沿血肿冠状面切下厚2 mm的脑片，经常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋，连续作厚度为5μm的石蜡切片制备用于HE染色。7 d组腹主动脉取血，做双抗体夹心-酶联免疫吸附实验。

2.4 HE染色 HE染色步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至脱水。流水冲洗10 min。苏木素染色20 min。充分水洗。0.5%伊红染液5 min。流水冲洗10 min。滴度乙醇脱水、二甲苯透明。中性树胶封片。光镜下观察血肿面积大小、血肿及其周围组织的病理学变化等。图片见附图。

2.5 双抗体夹心-酶联免疫吸附实验 主要步骤如下：实验前20 min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温（20～25℃）。取出所需数量的板条，其余密封放回4℃。建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100μL，第一孔加标准品100μL，混匀后用加样器吸出100μL，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μL弃去，使之体积均为100μL。第八孔为空白对照。加样：待测品孔中每孔各加入待测样品100μL。将反应板置37℃，120 min。洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。每孔中加入第一抗体工作液（ICAM-1 100μL／TNF-α50μL）。将反应板置37℃，60 min。洗板：同前。每孔中加酶标抗体工作液100μL。将反应板置37℃，60 min。洗板：同前。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗处反应5～10 min。每孔加入1滴终止液混匀。在492 nm处测吸光值（应尽快，时间过长可能导致本底偏高）。结果计算与判断：所有OD值都应减除空白值后再行计算。ICAM-1：以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31、0 ng／mL之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。TNF-α：以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0 pg／mL之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。将浓度作为X轴，OD值作为Y轴，曲线应为一光滑曲线。根据样品OD值在该曲线上查出相应大鼠ICAM-1／TNF-α含量。

2.6 统计方法 采用SPSS 13.0进行数据统计分析，数值采用表达，3组间比较采用ANOVA分析，两两比较用t检验。

3 结果

3.1 HE染色发现，假手术组双侧脑组织结构致密，细胞排列整齐，胞浆淡染，核仁清楚（附图1、4）。

模型组各标本右侧尾状核均有大片出血灶，病灶边缘血管扩张，出血灶周围脑组织显著水肿，组织疏松，出血灶周围有少量胶质细胞，神经细胞肿大、疏松、空泡样变性或皱缩；神经纤维排列紊乱、皱缩及断裂，出现空泡；大量炎性细胞浸润，血管腔内红细胞聚集嵌塞微血管；7 d时出血灶可见含铁血黄素颗粒，形成胶质瘢痕结节，并出现空洞（附图2、5）。三七总皂苷组出血灶部分吸收、机化，周围脑组织水肿显著减轻，神经纤维排列紊乱现象显著减轻（附图3、6）。模型组和三七总皂苷组健侧脑组织为正常组织形态。

3.2 造模7 d时，模型组血清中的ICAM-1含量增加（与假手术组比较P＝0.025），三七总皂苷组低于模型组（P＝0.031），三七总皂苷组含量与假手术组差异无统计学意义（P＝0.862）。造模7 d，TNF-α含量呈现模型组＞三七总皂苷组＞假手术组，但组间比较差异 均无统计学意义，如表1所示：

表1 造模7 d血清ICAM-1和TNF-α含量的组间比较（pg／mL）（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别 ICAM-1含量（n＝8）TNF-α含量（n＝8）310.50±16.6 0.224±0.029模型组 350.50±39.30* 0.239±0.023三七总皂苷组 312.00±17.39△假手术组0.228±0.024

4 讨论

胶原酶注射法诱导ICH，胶原酶对脑血管基底膜具有破坏作用，脑内血管破裂，血液进入脑组织内。造模48 h后取材经HE染色，在光学显微镜下观察，红细胞弥漫于基底核区并可见血肿的形成。血肿区神经元结构模糊，变性坏死，细胞皱缩浓染，血肿周围区内可见组织疏松，细胞不同程度水肿。作为机体的一种防御反应，出现白细胞浸润和小胶质细胞激活。活化的白细胞可发生流变学改变，表现为变形性降低和黏附性、聚集性增高，嵌塞微血管，导致微循环有效面积减少。健侧无明显上述改变。随着出血后病程的发展，机体进行损伤后的修复。在出血后7 d，在基底核出血区可见胶质瘢痕形成，由于小胶质细胞吞噬了大量的红细胞，形成了含铁血黄素颗粒。三七总皂苷组血肿体积小于模型组，提示三七总皂苷有一定促进血肿吸收的作用。本实验造模后脑组织可见血肿、组织水肿和纤维化，因此组织病理学上符合血瘀征象。此外，HE染色观察到炎性细胞浸润也证实了脑出血急性期炎性反应较剧烈。

ICH后存在明显的炎性反应，ICAM-1和TNF-α不同程度升高，可能加重继发性脑损伤。早期使用三七总皂苷可促进ICH后神经功能缺损的恢复，抑制炎性反应递质ICAM-1的表达，一定程度下调TNF-α，减轻神经元损伤可能是三七总皂苷的治疗机制之一。何氏［2］报道三七总皂苷可抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注后ICAM-1表达和中性粒细胞浸润，减轻脑梗死区炎性反应，主要机制为抑制炎性反应递质释放和降低血脑屏障通透性，减轻脑水肿，提示三七总皂苷有一定的抗炎作用。ICH后血肿周围炎性反应的前提条件是炎性细胞黏附于血管内皮细胞，黏附分子是介导黏附的重要因素，其中ICAM-1起着核心作用，也介导炎性细胞参与血脑屏障内皮细胞损害的病理过程。ICH早期ICAM-1广泛分布于上皮细胞、血管内皮细胞、网状细胞、单核细胞和淋巴细胞，其中以血管内皮细胞表达最强，引起中性粒细胞浸润，释放大量活性氧，参与继发脑损伤［3］。同时，表达ICAM-1的白细胞活化后产生大量的蛋白水解酶，特别是基质金属蛋白酶（MMPs），氧自由基、花生四烯酸代谢产物等，增加血脑屏障通透性，形成血管源性脑水肿［4］。正常情况下，ICAM-1可以在内皮细胞有低水平的表达，但在炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1、IFN-γ等刺激下表达可明显增高。ICAM-1还可以从血管内皮细胞表面脱落，成为可溶性细胞间黏附分子-1（soluble-ICAM-1，sICAM-1），但仍保持与LFA-1结合的功能，缺血性卒中患者血清中可溶性ICAM-1的水平与脑组织、血脑屏障的损坏程度有关［5］。实验研究证明，大鼠ICH后24 h血管内皮出现ICAM-1，7 d达高峰，持续2周［6］。

ICH后神经元、星形细胞和小胶质细胞均可产生TNF-α，它是炎性反应的触发因子，一方面脑组织损伤后星形细胞、血管内皮细胞以及小胶质细胞首先表达TNF-α，另一方面由TNF-α可直接促进中性粒细胞向病灶区聚集，诱导白细胞、受损组织细胞释放更多的细胞因子，这是前炎性反应细胞因子形成的一个正反馈机制。TNF-α还具有神经毒性作用，表达增加可加速细胞死亡。而TNF-α神经毒性和促细胞死亡的作用可能会使血脑屏障破坏，通透性增加，引起脑水肿［7］。7 d时血清TNF-α虽成模型组＞三七总皂苷组7＞假手术7的趋势，但并无统计学意义，查阅相关文献发现，TNF-α在ICH后24～72 h之间达到高峰，之后下降，故考虑此阴性结果与造模7 d时TNF-α已自行下降有关。

［1］包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京：人民卫生出版社，1991：24-48.

［2］何蔚，朱遵平.三七总皂苷对大鼠脑梗死区ICAM-1表达和中性粒细胞浸润的影响［J］.中药材，2005，28（5）：403-405.

［3］智迄惠，黎杏群，罗云，等.NF-κB及ICAM-1在脑出血大鼠及过氧化氢损伤大鼠脑微血管内皮细胞中的表达［J］.中国病理生理杂志.2007，23（4）：693-698.

［4］梁志刚，刘兆孔，高晓兰，等.脑出血大鼠血肿周围脑组织细胞间黏附分子的表达与脑水肿的关系［J］.临床神经杂志，2006，19（1）：67 -69.

［5］Pleines UE，Stover JF，Kossmann T，etal.Soluble ICAM-1 in CSF coincides with the extent of cerebral damage in patientswith severe traumatic brain injury［J］.Neurotrauma，1998，15（6）：399-409.

［6］Chao g，Julian T H，RICHard F K.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rats［J］.Brain Res，2000，871（1）：57-65.

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（2013-04-09收稿）

The Effect of Early Use of Panax Notoginseng Saponins on Inflammation in Ratsw ith Cerebral Hemorrhage

Zhao Xuesong，Chen Zhigang，Xu Zhifang，Gao Fang
（Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

Objective：To study the effect of early use of Panax notoginseng saponins（PNS）on the pathomorphological brain tisssues，ICAM-1and TNF-αin rats with cerebral hemorrhage（ICH）.M ethods：SD rats were randomly divided into sham group，model group and PNSgroup，and ICH models weremade with collagenaseⅦinjected into the rats’caudate nucleus.Themorphological changes in the brain were observed.ICAM-1 and TNF-αin the serum were measured by the method of enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：The region around the hematoma infiltrated by inflammatory cellswas observed by HSstaining，and PNSsignificantly reduced the brain edema andameliorated disorderly arrangement of nerve fibers；On the 7th day after ICH，the level of ICAM-1 and TNF-αin the serum was still higher in themodel group compared with that in the sham group，and the administration of Panax notoginseng saponins down-regulated ICAM-1（P＜0.05）and TNF-α.Conclusion：Panax notoginseng saponins can alleviate the pathomorphological brain tissues of cerebral hemorrhage，and it could inhibit the release of ICAM-1 and TNF-αso as to protect the neurons.

Cerebral hemorrhage；Brain pathomorphology；ICAM-1；TNF-α；Panax notoginseng saponins

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.07.027脑出血（Intracerebral Hemorrhage，ICH）是一种最危重的卒中类型，具有发病急、变化快、病情危重、病机复杂等特点，临床必须紧急救治，目前缺乏有效的、针对性强的治疗手段。近年研究表明脑出血血肿周围组织有炎性反应存在，较非出血性脑损伤明显，且在脑出血的继发性损伤中具有重要意义。本研究用三七总皂苷（PNS）干预实验脑出血大鼠，观察其对脑组织病理形态的改变和炎性反应递质的影响，为使用三七总皂苷早期治疗脑出血提供理论依据和支持。

高等学校博士学科点专项科研基金（新教师类）（编号：2011001312001）；北京中医药大学科研创新团队项目中医脑病形神一体化防治研究团队（编号：2011-CXTD-23）

赵雪松（1981—）男，在读博士研究生，研究方向：中医内科学脑病，E-mail：13811347860＠139.com

陈志刚（1964—），男，主任医师，博士生导师，硕士，研究方向：中医内科学脑病，E-mail：zgchen01＠yahoo.com.cn