基于QbD理念的丹参醇提工艺设计空间的建立与验证

罗 赣 徐 冰 刘 倩 李 洋 史新元 乔延江

（北京中医药大学中药信息工程研究中心，北京，100029）

基于QbD理念的丹参醇提工艺设计空间的建立与验证

罗 赣 徐 冰 刘 倩 李 洋 史新元 乔延江

（北京中医药大学中药信息工程研究中心，北京，100029）

目的：建立并验证丹参醇提工艺的设计空间。方法：以隐丹参酮、丹参酮IIA提取率为关键质量属性（CQA），以乙醇浓度、乙醇倍量、煎煮时间为关键工艺参数（CPP），采用中心点复合设计安排实验，基于二次多项式回归模型开发丹参醇提工艺设计空间。结果：方差分析结果显示模型的P值均小于0.05，且失拟值均大于0.1，表明该模型可以较好的描述CQA和CPP之间的关系.设计空间以Overlay plot展示，在加入95%置信区间后，可缩小设计空间范围并提高其可靠性。结论：基于质量源于设计（QbD）理念建立丹参醇提工艺设计空间可以提高工艺过程的稳健性和灵活性。

质量源于设计；丹参；乙醇提取；设计空间；过程稳健性

人用药物注册技术标准国际协调会（ICH）于2005年出台的ICH Q8［1］中提出了“质量源于设计（Quality by Design，QbD）”的理念，QbD是将科学的方法和风险管理的理念应用于药品工艺开发和生产全过程。实施QbD的核心之一在于为制剂工艺建立设计空间。在ICH Q8中设计空间被定义为：可以确保产品质量的输入变量（例如原材料的质量属性）和工艺参数之间的多维组合与相互作用。

目前，设计空间已应用于化学药品的干燥［2］、混合［3］、制粒［4］、包衣［5］等生产过程，以及生物制品的菌苗培养［6］等过程，但在中药制剂生产过程中的应用较少［7-8］。本文以丹参醇提过程作为研究对象，“将质量源于设计”的理念和“设计空间”（Design space）的方法应用于中药提取过程，从设计层面保证丹参提取物的质量，利用响应面方法设计实验，建立基于QbD理念的丹参醇提工艺设计空间并进行了验证。

1 仪器与试药

Agilent1100液相色谱仪（美国安捷伦公司）；电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）、DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）、Sartorius BS210S天平（德国赛多利斯公司）。

丹参饮片（购自北京本草方源药业有限公司，批号20120402），对照品隐丹参酮、丹参酮IIA（购自中国食品药品检定所，批号分别为110852-200806和110766 -200619），乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher），其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 丹参提取物制备 取丹参饮片500 g，加乙醇回流提取2次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩，80℃干燥，粉碎成细粉。

2.2 丹参药材中隐丹参酮和丹参酮IIA的含量测定

1）对照品溶液的制备：精密称取隐丹参酮、丹参酮IIA适量，以甲醇为溶剂，配置成浓度为含隐丹参酮30 μg／mL、丹参酮IIA 130μg／m L的混合对照品溶液。

2）供试品溶液的制备：取丹参粉末（过三号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1h，放冷，甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

3）色谱条件：Agilent SB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温25℃，流速1mL／min，流动相为甲醇：水＝75：25，检测波长270 nm。

2.3 丹参醇提物中隐丹参酮和丹参酮IIA的含量测定 1）对照品溶液的制备：同2.2项下“对照品溶液的制备”。

2）供试品溶液的制备：取丹参醇提物约10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过0.45μm滤膜，取续滤液即得。

3）色谱条件：Agilent SB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温25℃，流速1 mL／min，流动相为乙腈-0.026%磷酸水溶液，梯度洗脱，梯度设置如表1，检测波长为270 nm。

表1 梯度洗脱表

2.4 响应面实验设计

2.4.1 关键质量属性（CQA）和关键工艺参数（CPP）的确定：目标成分隐丹参酮（Y1）和丹参酮IIA（Y2）的提取率作为CQA，乙醇浓度（A，80%～100%），乙醇倍量（B，6～12倍），煎煮时间（C，0.5～3小时）作为CPP。拟定工艺目标为隐丹参酮和丹参酮IIA的提取率分别大于70%和50%。

2.4.2 中心点复合设计 利用Design expert8.0软件安排20次实验（α值选择1，中心点重复6次）。因素水平如表2所示。

表2 丹参醇提因素水平表（α＝1）

3 结果与讨论

3.1 实验结果

3.1.1 丹参药材隐丹参酮和丹参酮含量测定结果本批次药材中丹参中隐丹参酮含量为（2.9±0.00834）mg／g（n＝3），丹参酮IIA含量为（4.7±0.0221）mg／g（n＝3），药材质量符合药典要求。

3.1.2 提取率实验结果 根据中心点复合实验设计安排进行工艺操作，根据出膏率、丹参醇提物中隐丹参酮含量、丹参酮IIA含量计算隐丹参酮（Y1）、丹参酮IIA提取率（Y2），结果如表3。

表3 CCD实验数据

表4 方差分析表-Y1

3.2 模型的建立及评价

3.2.1 模型的建立 采用二次多项式模型对两个CQA（Y1，Y2）及相应的CPP（A，B，C）分别进行拟合，Y1和Y2的的回归方程分别是：

二方程的拟合相关系数R2分别是0.7466和0.7595，表明响应值Y1和Y2实际值与预测值之间具有较好的的拟合度，因此可以使用此模型来预测隐丹参酮和丹参酮IIA提取率的实际情况。

3.2.2 方差分析 方差分析结果以Y1为例，如表4所示。

可以看出，对于Y1和Y2，模型的P值均小于0.05（显著），且失拟值均大于0.1（不显著），表明所建模型可靠，各因素与响应值之间的关系可以用此模型函数化。乙醇浓度A，乙醇倍量B，煎煮时间C的P值均小于0.05，表明A、B、C三个因素对Y1，Y2具有显著影响，且影响程度排序均为A＞B＞C。但AB，AC，BC的P值均小于0.05，表明A、B、C三个因素的交互作用对Y1，Y2的影响不显著。

3.3 响应面分析 以Y1为例，图1为隐丹参酮的提取率随乙醇浓度和乙醇倍量变化的响应面图，图2为隐丹参酮的提取率随乙醇浓度和煎煮时间变化的响应面图。

图1 乙醇浓度和乙醇倍量对隐丹参酮（Y1）提取率影响的响应面图

图2 乙醇浓度和煎煮时间对隐丹参酮（Y1）提取率影响的响应面图

由上图可以直观的看出，乙醇浓度A对于Y1和Y2的影响相比乙醇倍量B和煎煮时间C更大，与方差分析结果一致。在规定的范围内，乙醇浓度越高，煎煮时间越短，有效成分的提取率就越高，这也符合了隐丹参酮和丹参酮IIA两种醇溶性成分遇热不稳定的特点［9］。

3.4 设计空间的建立 在设定的参数空间内搜索同时满足两个目标（Y1＞70%，Y2＞50%）的所有因素组合，即构成设计空间，结果用Overlay Plot展示，如图3所示。

图3 不带有置信区间的丹参醇提工艺的设计空间

由图3可以看出，白色部分即为丹参醇提工艺的设计空间，但由于模型的预测值与真实值之间存在一定差异，所以设计空间的边界具有不确定性。为了应对设计空间边界的不确定性，在定义设计空间时可加入置信水平α＝0.05的置信区间，将设计空间优化，结果应用Overlay plot展示，如图4所示。

图4 加入95%置信区间的丹参醇提工艺的设计空间

由图4可以看出，白色部分即为优化后的设计空间，即整个空间内所有的点的估计值都符合工艺目标要求（Y1＞70%，Y2＞50%），深灰色部分属于原有设计空间内不可靠的部分，即此空间内的估计值有5%的概率无法满足原有的工艺目标要求。

3.5 验证实验 在图4中选取5个不同区域内的的点来做验证实验，5点的选取如表5所示。验证实验结果如表6所示。

表5 验证实验点的选取

表6 设计空间验证实验结果

由验证实验结果可知，YZ1、YZ2和YZ5均符合预设要求。YZ3和YZ4中Y1＜70%，Y2＞50%，Y2均符合预设要求而Y1却没有达到，这表明由于95%置信区间的加入，相比未加入95%置信区间，设计空间边界的不确定性得到了较好的印证。

4 结论

本文采用中心点复合设计对丹参醇提工艺进行优化，并构建了丹参醇提工艺的设计空间。加入95%置信区间后，设计空间的范围有所缩小，提高了设计空间的可靠性。实验结果表明，基于QbD理念建立丹参醇提设计空间可提高工艺过程的稳健性和可靠性。

［1］International Conference on Harmonisation，ICH Q8（R2）：Pharmaceutical Development，2009.

［2］Pisano R，Fissore D，Barresi A A，et al.Quality by design：optimization of a freeze-drying cycle via design space in case of heterogeneous drying behavior and influence of the freezing protocol［J］.Pharmaceutical Development and Technology，2013.18（1）：280-295.

［3］Martinez L，Antonio P，Lorenz L，etal.Use of near-infrared spectroscopy to quantify drug content on a continuous blending process：Influence of mass flow and rotation speed variations［J］.European Journal of Pharmaceutics，2013，84（3）：606-615.

［4］Defne Kayrak-Talay，Dale Steven，Wassgren Carl，et al.Quality by design for wet granulation in pharmaceutical processing：Assessing models fora prioridesign and scaling［J］.Powder Technology，2013，240：7-18.

［5］Teckoe Jason，Mascaro Tracey，Farrell Thomas P，et al.Process Optimization ofa Novel Immediate Release Film Coating System using QbD Principles［J］.AAPSPharmscitech，2013，14（2）：531-540.

［6］Streefland.M，Van Herpen PFG，Van deWaterbeemd B，etal.A practical approach for exploration and modeling of the design space of a bacterial vaccine cultivation process［J］.Biotechnol Bioeng，2009，104（3）：492-504.

［7］徐冰，史新元，乔延江，等.中药制剂生产工艺设计空间的建立［J］.中国中药杂志，2013，38（6）：924-929.

［8］徐冰，罗赣，林兆洲，等.基于过程分析技术和设计空间的金银花醇沉加醇过程终点检测［J］.高等学校化学学报，2013，34（10）：2284-2289.

［9］翟学佳.丹参药材热不稳定性考察及提取工艺优化［J］.中国医院药学杂志，2009，29（19）：1619-1622.

（2013-10-30收稿）

Establishment and Verification of Design Space of Ethanol Extraction Process of Salvia M iltiorrhiza based on Quality by Design

Luo Gan，Xu Bing，Liu Qian，Li Yang，Shi Xinyuan，Qiao Yanjiang
（Research Center of TCM information Engineering，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective：To establish and verify the design space of ethanol extraction process of Salviamiltiorrhiza.Method：The extraction ratios of cryptotanshinone and Tanshinone IIA are identified as the critical quality attributes（CQAs），and ethanol concentration，ethanol amount，decoction time are identified as critical process parameters（CPPs）.The central composite design is used for experimental arrangements，and the design space of ethanol extraction process of Salviamiltiorrhiza is established based on the quadratic polynomial regressionmodel.Result：Since the p-values of bothmodels are less than 0.05 and values of lack of fit aremore than 0.1，the relationship between CQAs and CPPs could be well described by the twomodels.The reliability of design space，illustrated by overlay plot，is improved with the addition of 95%confidence.Conclusion：The robustness and flexibility of Salviamiltiorrhiza ethanol extraction process have been enhanced via the establishment of design space based on the quality by design（QbD）concept.

Quality by Design（QbD）；Salviamiltiorrhiza；Ethanol extraction process；Design Space；Process robustness

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.006

北京中医药大学自主选题项目“中药提取物化学、物理属性的全息快速评价研究”（编号：532／0100604295）；2013年省部级“中药基础与新药研究”重点实验室开放课题资助

罗赣（1986—），男，北京中医药大学中药学院

乔延江，男，博士，教授，博士生导师，主要从事中药信息学研究，北京市朝阳区北三环东路11号，邮编：100029，E-mail：yjqiao＠263. net；徐冰，博士，讲师，研究方向为中药制药过程分析与控制，邮编：100102，E-mail：btcm＠163.com