超声实时组织弹性成像评价大鼠肝纤维化分期

肝纤维化甚至早期肝硬化具有可逆性，早期诊断肝纤维化，有效地阻断或干预肝纤维化进程具有重要意义。目前肝脏活检是诊断肝纤维化的“金标准”[1]，但其为有创检查、穿刺部位局限，患者不易接受。本实验采用超声实时组织弹性成像（RTE）建立大鼠肝纤维化模型，获得不同纤维化程度的肝脏应变比（SR），分析SR与病理肝纤维化分期的相关性，探讨一种无创评价肝纤维化分期的新方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康Wistar大鼠80只，雄性，体重280～300 g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供，清洁级，置于温度18～23℃、相对湿度40%～70%的屏障系统内饲养，饲喂标准颗粒饲料，自由饮水。采用抽签法选取64只大鼠为实验组，制作大鼠肝纤维化模型；另外16只为对照组。

1.2 动物模型建立 实验组大鼠首次按4 ml/kg经腹腔注射60% CCl4橄榄油溶液，以后每周3次按2 ml/kg注射。对照组大鼠首次按4 ml/kg经腹腔注射生理盐水，以后每周3次按2 ml/kg注射。分别于第4周、6周、8周、10周采用抽签法随机从实验组中取16只、从对照组中取4只大鼠进行肝脏RTE检查。

1.3 大鼠肝脏RTE检查 检查前大鼠禁食水8 h，采用10%水合氯醛按3 ml/kg腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位固定于平板上，剪去肝区体毛。采用日立HV900彩色多普勒超声诊断仪，配备弹性成像软件包，使用线阵探头行超声扫查，频率6～13 MHz。①先用二维成像模式常规扫查肝脏，观察肝实质回声改变。②将大鼠开腹并充分暴露肝脏，在肝脏表面加盖硅胶垫（要求透声性好，有一定弹性，厚度约0.5 cm，声速接近于人体软组织平均值，能够反复使用），涂耦合剂使硅胶垫与探头之间无空气存留。选取大鼠肝右叶切面（均匀的肝实质回声区，尽量避开肝脏血管和胆道），开启弹性成像功能，选取感兴趣区，包括硅胶垫及2 cm深度肝组织，在探头轴向上轻微震动加压，压力分数控制在3，获取稳定弹性图像，冻结。③选择“Strain Ratio”测量项，用方形取样框在弹性图像内分别获取肝脏部位应变值（A）和硅胶垫部位应变值（B），自动获得B/A值，即SR。解冻，重新获取另一幅弹性图像，测量3次后取平均值。

1.4 病理检查 完成RTE检查后，以脊椎脱臼法处死大鼠，剪取肝右叶，立即以10%甲醛固定48 h以上，石蜡包埋，行4 μm厚连续切片、HE染色、Masson染色、网状纤维染色。病理科消化专业医师在未知超声弹性应变比结果的情况下对肝纤维化程度进行分析。

1.5 肝纤维化分期标准 根据2000年全国病毒性肝炎病理诊断标准[2]，将肝纤维化分为5期：S0，无纤维化；S1，汇管区扩大纤维化，局限窦周及小叶内纤维化；S2，汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；S3，大量纤维间隔形成伴小叶结构紊乱，无肝硬化；S4，早期肝硬化。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件，不同肝纤维化分期组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD法。超声弹性评价结果与病理分期结果行Spearman相关分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型建立情况 对照组16只大鼠全部成活，饮食正常，体重增加，毛发光泽。实验组大鼠食量减少，精神状态不佳，体重下降，毛发多汗无光泽，其中55只造模成功，9只大鼠给药2周后陆续死亡。

2.2 病理表现 对照组大鼠肝脏表面光滑，肝缘锐利，颜色鲜红，质地柔软；镜下见肝小叶结构正常，无变性、坏死，无纤维间隔形成。实验组大鼠病理肝纤维化分期：S0期2只，S1期19只，S2期10只，S3期10只，S4期14只。S1期镜下见肝细胞点、灶状坏死；S2期可见中央静脉、汇管区纤维组织增生，纤维间隔形成；S3期可见大面积肝细胞变性坏死，中央静脉周围及汇管区大量纤维间隔形成，肝小叶结构紊乱；S4期见正常肝小叶结构消失，纤维间隔包绕形成假小叶。

2.3 RTE结果 大鼠肝纤维化病理分期及SR结果见表1和图1～4。各纤维化分期组间比较，差异有统计学意义（F=34.08,P＜0.001），其中S0期与S1期比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；S0期与S2期、S3期、S4期比较，差异有统计学意义（P＜0.001）；S1期与S2期、S3期、S4期比较，差异有统计学意义（P＜0.001）；S2期与S3期比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；S2期与S4期比较，差异有统计学意义（P＜0.001）；S3期与S4期比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 RTE结果与肝纤维化分期的相关性 RTE应变比与肝纤维化分期呈显著正相关（r=0.799,P＜0.05）。随肝纤维化程度加重，RTE应变比随之增加。

表1 各期肝纤维化弹性成像应变比比较

3 讨论

3.1 肝纤维化的影像诊断 影像学检查是目前诊断肝纤维化最简单易行的方法之一，能客观、无创、真实地还原肝脏受累部位及了解肝脏形态，广泛应用于临床。超声、CT、MRI及核医学均可以从形态学以及血流、弹力、代谢、功能等方面加强对肝纤维化的诊断和认识，在肝纤维化诊断中具有重要作用。二维超声检查能显示肝脏切面的形态、大小、肝实质结构及管道系统；彩色多普勒超声能显示肝脏的血流，并对其血流动力学进行测定；声学造影能有效增强肝脏的二维超声信息，反映正常组织和病变组织不同的血流灌注、造影剂分布和影像动态变化。在显示肝脏整体解剖和肝脏与相邻组织关系以及在动态增强扫描和功能性检查方面，CT和MRI均具有明显优势。CT灌注成像和MRI频谱分析对肝纤维化的诊断有一定作用，但其临床意义有限。

图1 A. S0期肝纤维化大鼠Masson染色镜下见肝细胞无明显变性坏死，少量脂肪浸润，汇管区无炎症细胞浸润（×100）；B.参照物与该大鼠肝脏的应变比为0.43

图2 A. S1期肝纤维化大鼠Masson染色镜下见小叶中央静脉周围肝细胞肿胀，汇管区扩大，炎症细胞浸润（×100）；B.参照物与该大鼠肝脏的应变比为0.42

图3 A. S2期肝纤维化大鼠Masson染色镜下见肝细胞水肿，中央静脉周围及汇管区周围纤维间隔形成（×100）；B.参照物与该大鼠肝脏的应变比为0.68

图4 A. S4期肝纤维化大鼠Masson染色镜下见正常肝小叶结构消失，大量纤维间隔包绕形成假小叶（×100）；B.参照物与该大鼠肝脏的应变比为0.93

3.2 RTE评价肝脏纤维化的原理 肝脏纤维化级别与弹性模量的相关性极高[3]，弹性模量是指材料在外力作用下产生单位弹性变形所需要的应力，如果能够准确测量出肝的弹性模量，就能够获得纤维化级别这一重要临床信息。

1991年，Ophir等[4]首先提出超声弹性成像的概念。目前，日立公司开发的RTE为压迫性弹性成像，弹性模量小、受压后位移变化大的组织显示为红色，弹性模量大、受压后位移变化小的组织显示为蓝色，弹性模量中等的组织显示为绿色，从而以图像色彩较客观地反映组织的硬度[5,6]。本实验观察的变量是同一硅胶垫与各期纤维化大鼠肝脏的应变比，并与病理结果相比较。应变是指在外力作用下物体的变形量与原来尺寸的比值。应变比工具是在感兴趣区内获取两个取样框内应变的比值，它能够不受主观因素影响得到两物体在外力作用下形状的改变量。实验中使用的硅胶垫在水温19℃、超声频率2 MHz下测得声速为1417 m/s，与人体软组织均值1540 m/s接近，不影响后方肝脏成像，并且有一定的形变能力，可以反复使用。测量同一恒定参照物与各期纤维化肝脏的应变比，更能客观、有效地反映肝脏硬度的变化。

3.3 RTE评价肝脏纤维化的价值 本实验结果显示，RTE应变比与肝纤维化分期呈显著正相关（r=0.799,P＜0.05），随着肝纤维化程度的加重，RTE应变比相应增加。除S0期与S1期、S2期与S3期比较差异无统计学意义外，其余各期两两比较差异均有统计学意义。因此，根据应变比大小可以将S1期、≥S2期、S4期区分诊断，提示RTE能够比较准确地诊断不同时期的肝纤维化，与裴书芳等[7]及Kanamoto等[8]的临床研究结果基本一致。袁鹰等[9]通过结扎大鼠肝内胆管制成胆汁淤积型肝纤维化模型，采用RTE分别观察结扎7 d、结扎7 d及对照组（未结扎）的大鼠肝脏，结果证实胆管结扎14 d后大鼠肝纤维化形成，该组的弹性成像评分与另外两组间差异有统计学意义，RTE对于早期诊断大鼠肝纤维化有意义。

瞬时弹性成像是近年用于诊断肝纤维化的无创性新技术[10]，属于一维超声成像模式，不能实时产生二维图像，因此检查中无法确保避开脂肪、胆囊和血管等组织结构的影响，并且由于脂肪组织将对低频剪切波和超声波产生强烈的衰减作用，瞬时弹性成像不宜用于肥胖者及肋间隙过窄者[11]。声辐射压力脉冲可以实时呈现二维图像，但其取样框较小（0.6 cm×1.0 cm）。RTE在实时显示弹性图像的同时能同步观察二维图像，准确定位感兴趣区。Koizumi等[12]研究表明，RTE应变比不受皮下脂肪厚度、体重指数和脂肪肝的影响，可以客观地反映肝纤维化程度。

3.4 本实验的特点及局限性 本实验采用RTE应变比评价肝纤维化程度，不同于以往根据取样框内颜色评分的方法[7,9]，能够较客观地反映肝组织硬度，并且以同一硅胶垫作为参照物，相比与自身脂肪或肌肉[8]对照更具有客观性。本实验为动物实验，最终病理以整块动物肝组织切片诊断，取样面积大，代表性好。

尽管本实验中采用的硅胶垫声速与人体软组织接近，但它并非常规超声诊断辅助设备，尚无统一的弹性标准，因此，本实验获得的数据无法与其他类似实验直接比较。此外，本实验为避免皮下软组织干扰、直接获取硅胶垫与大鼠肝脏的弹性信息，采用开腹成像，未来如何应用于临床，有待进一步探讨和完善。

总之，RTE为无创性诊断肝纤维化分期提供了一种新方法，对半定量评价肝纤维化具有较好的研究价值，有望为日后人体肝纤维化的研究提供初步参考。

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