山东部分地区鸡源致病性大肠埃希菌优势血清型筛选及致病力试验

贾 宁，王 平，陆 红，郭妍妍，杨超群，郑小奇，尹燕博＊

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.青岛澳兰百特生物工程有限公司，山东青岛 266101；3.青岛市畜牧局，山东青岛 266000；4.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

山东部分地区鸡源致病性大肠埃希菌优势血清型筛选及致病力试验

贾 宁1，王 平2，陆 红3，郭妍妍2，杨超群2，郑小奇4，尹燕博1＊

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.青岛澳兰百特生物工程有限公司，山东青岛 266101；3.青岛市畜牧局，山东青岛 266000；4.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

收集山东省部分地区养鸡场送检病料，对该区域鸡致病性大肠埃希菌的血清型分布、致病力情况进行了研究。在送检的108份病料中分离到80株大肠埃希菌，分离率为74.0%。通过血清型鉴定试验，定型O抗原共74株，分为9个血清型，即O2、O78、O157、O35、O103、O6、O18、O178和O55。其中优势血清型为 O2型23.0%（17／74）、O35型20.2%（15／74）、O78型17.6%（13／74）3种，占定型菌株的61.2%，占待检菌株的56.2%。说明山东地区鸡大肠埃希菌血清型分布具有复杂性的特点。

鸡大肠埃希菌；致病力；血清型

禽大肠杆菌病是由致病性大肠埃希菌引起的一种传染病，剖检病变主要包括肝周炎、纤维素性心包炎、脐炎、败血症、腹膜炎、气囊炎等［1－3］。随着肉鸡养殖业呈上升态势，肉仔鸡大肠杆菌病流行势头近几年迅速抬头，给相关养殖场造成严重经济损失。本试验对山东部分地区的禽大肠杆菌病进行了血清学调查、强致病菌株筛选，目的在于查清本地区的主要流行菌株，为疫苗研制和防治本病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

待检菌株于2011年－2012年间青岛澳兰百特生物工程有限公司诊断中心送检病料中分离得到。标准O型单因子血清购于中国兽药监察所。动物试验所用肉仔鸡购于莱西某养殖场。试剂均为青岛澳兰百特生物工程有限公司诊断中心提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 无菌采集病鸡、濒死鸡的肝脏、心血划线接种于麦康凯琼脂平板、伊红美蓝平板、营养琼脂平板，37℃培养18h～20h。同时进行涂片、革兰染色，观察细菌形态特点。

1.2.2 生化试验 选取上述分离出的典型菌落纯培养后，按常规方法［4－5］对所有分离株进行三糖铁试验（TSI）、葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖发酵试验、吲哚试验、MR试验、VP试验、枸橼酸盐试验、脲酶试验。

1.2.3 O抗原的制备及血清型鉴定 已纯培养的菌株划线接种在营养琼脂斜面上，37℃培养18h～20h。用5g／L石炭酸生理盐水2mL洗脱菌苔，制成浓稠菌悬液，121℃高压2h，破坏其K、H抗原，得到O抗原。通过玻板凝集试验，用标准O型分型血清，对所分离的菌株进行血清型鉴定。经0～5min（或适当延长反应时间）出现凝集者判为阳性，以“＋”表示；同时以高压抗原与5g／L石炭酸生理盐水混合作对照，观察有无自凝现象。

1.2.4 致病力试验及不同血清型间病理变化观察

将14日龄健康雏鸡110只，随机分成11组，每组10只。取经血清型鉴定的前3种优势血清型各3株，分别接种于普通营养肉汤中，恒温振荡培养箱中37℃培养12h～15h。肉汤培养物离心，去上清，生理盐水重悬（每毫升含菌量约109cfu），0.5mL进行腿 肌 注 射［6］。1 组 肌 注 无 菌 生 理 盐 水 （0.5 mL／只），作阴性对照组。1组肌注O2型标准毒株（0.5mL／只），作阳性对照组。各组在相同环境隔离饲养，连续观察1周，记录其发病、死亡数和不同血清型间剖检病变情况。

1周后扑杀存活鸡，将试验中有明显病变的肝脏、心血作为病料，进行感染菌的分离回收检验。致病力判定标准：攻毒后，能使鸡在24h内全部死亡或在48h内死亡2／3以上的菌株作为致病菌株。

2 结果

2.1 待检菌株的分离与理化特性

待检菌株在普通营养琼脂平板上形成半透明，中等大小，圆形光滑隆起，边缘整齐的菌落；在麦康凯琼脂平板上形成圆形、光滑、隆起、湿润、红色的菌落；在伊红美蓝平板上形成金属光泽的黑色菌落。通过革兰染色镜检发现有革兰染色阴性、中等大小、散在的、两端钝圆的杆菌。

2.2 生化试验结果

对分离到的80株菌进行了常规生化试验［7］，结果符合大肠埃希菌的特征。分离菌均能发酵多种碳水化合物（含葡萄糖），发酵乳糖迟缓，36株菌能发酵蔗糖；吲哚、MR试验阳性；VP试验阴性；均不能分解尿素。

2.3 血清学鉴定结果

利用玻板凝集反应法，对所分离到的80株大肠埃希菌进行血清学鉴定。74株能够定型，占被检菌株的92.5%，属于9种不同的O血清群；未鉴定出的6株，占被检菌株的7.5%（表1）。从表1可以看出，定型菌 株 所 占 比 例 为 O2（23.0%）、O35（20.4% ）、O78（17.8%）、O157（10.8%）、O6（8.0%）、O178（7.0%）、O18（5.0%）、O103（4.0%）和O55（4.0%）。由高到低选取3种，故优势血清型为O2、O35、O78。

表1 大肠埃希菌血清型鉴定结果（n＝74）Table 1 Results of Escherichiacoli serotype identification（n＝74）

2.4 致病力试验结果

图1 病死鸡心包积液Fig.1 Pericardial effusion of sick chicken

图2 病死鸡心包炎，肝出血Fig.2 Fibrinous pericarditis and Liver hemorrhage in sick chicken

图3 病死鸡心脏表面覆盖纤维素性渗出物Fig.3 Fibrinous exudate on the surface of heart in sick chicken

攻毒12h后各组鸡均表现精神沉郁，饮食欲下降或废绝。死亡高峰在接种后24h～48h。主要病变为心包积液，呈半浑浊状（图1），内脏充血出血、肝脏可见大小不一的出血点（图2），排出灰白色或黄绿色带血稀粪。接种48h后死亡鸡剖检表现为纤维素性心包炎（图3）、肝周炎（图4）。从死亡鸡或产生严重病变鸡体内均能分离到接种菌。对照组鸡全部健活，7d中未发现眼观病变、未分离到大肠埃希菌。

图4 病死鸡肝实质剥离纤维素性膜Fig.4 Fibrinous pseudomembranes in the liver of sick chicken

3种优势血清型O2、O78、O35致病性试验结果见表2。结果表明，9株菌中 O2-2、O78-1、O35-1为高致病菌株。

由表3可见，O2-1组主要病变为纤维素性心包炎，O2-2组主要病变为心包积液，O2-3组主要病变为肝周炎；O35-1组主要病变为心包积液，O35-2组主要病变为心包积液，O35-3组主要病变为纤维素性心包炎；O78-1组主要病变为肝周炎，O78-2组主要病变为心包积液，O78-3组主要病变为纤维素性心包炎。这表明同一血清型的不同菌株可以有不同的临床剖检病变，不同血清型菌株间剖检病变也具有一定的差异性，说明菌株的血清型与致病性并无明显相关性。

表2 优势菌株动物致病性试验结果Table 2 The pathogenic in results of predominant strains experimental chickens

表3 不同血清型间病理变化观察结果Table 3 Observation results of pathological lesions by different serotypes

3 讨论

本试验从山东地区病、死鸡中分离到80株细菌，经细菌分离培养、形态学检查、生化鉴定和血清学试验证实后，表明分离菌为鸡致病性大肠埃希菌。从80株大肠埃希菌中鉴定出O2、O78、O35、O157、O103、O6、O18、O178和O55九种血清型，其中O2、O35、O78三型分别占被检菌株的23.0%、20.4%、17.8%，为该地区的鸡大肠埃希菌优势血清型。随后选用优势血清型菌株对商品肉仔鸡进行人工感染试验，筛选出3株高致病性菌株。通过鸡致病性大肠埃希菌血清型与病理变化之间的相关性分析，表明菌株的血清型与其临床病变无明显相关性。

随着畜牧业的现代化、集约化和规模化生产，目前多数养殖场饲养管理过程中滥用抗生素现象普遍存在［8］，更有甚者，将兽药用作饲料添加剂来降低动物发病率与死亡率、提高饲料利用率、促进生长和改善产品品质。这都将导致畜产品兽药残留［9］，人摄入后严重危害健康；而养殖动物所产生的包括粪便、尿等在内的排泄物，如未加处理就排放于周围环境中，兽药残留又会成为环境污染物，给自然生态环境带来不利影响。在这种恶劣的环境和态势之下，大肠埃希菌的耐药性愈加严重［10］，养鸡业的药物治疗成本不断加大，而疗效却越来越差。因此，研发出针对本地区使用的大肠埃希菌疫苗迫在眉睫。采用疫苗免疫不仅能有效遏制大肠杆菌病的广泛流行［11］，还可以有效控制鸡肉中的药物残留，使其更符合绿色食品要求。本试验从山东部分鸡场发病鸡分离筛选的3株高致病性大肠埃希菌菌株具有良好的代表性和普遍性，这些都为疫苗的研制打下了良好的基础。

据相关资料记载和报道，禽源大肠埃希菌的血清型众多。目前国外报道的血清型已达160多种［12－13］，其中能引起鸡发病的大肠埃希菌型别有50多种。常见的为 O1、O2、O78、O35、O36等［14］，但本次试验检出了 O103、O6、O18、O178、O157和O55几种血清型，这在山东地区鲜有报道，说明鸡大肠埃希菌在本地区流行情况日趋复杂。尤其是本次试验分离到的O157型，近年来在食品卫生领域受到高度关注。该型（O157∶H7）的致病因子主要有志贺毒素、溶血素，主要通过食物传播，也可经水和人间接触传播，致病力强。发生溶血性尿毒综合征之后死亡率极高，严重威胁人群健康，已成为不可忽视的流行病学与公共卫生问题［15］。自1982年首次在美国发现以来，在世界范围内已发生过多次食源性暴发。据相关流行病学调查表明，部分禽、畜是O157型的贮存宿主［16］，本次试验从鸡的心、血中分离到该型，也证实了这种观点。我国致病性微生物引起的食源性疾病现状表明，由肠道致病菌污染食品而引起的食物中毒以及疾病散发是直接造成人体健康损害的主要食源性危害。因此，应对我省家禽家畜和人群广泛开展调查，切实做好监测工作。通过被动监测、主动监测以及暴发监测，及时掌握疫情动态，采取和改进防治措施，防止大肠埃希菌O157∶H7引起流行和暴发流行。

另一方面，在不同地区、不同鸡场均存在有不同的O抗原群别分布［17］，这使该病的防治不容乐观，故建议养殖场应定期监测血清型动态变化，加强饲养管理，做好环境卫生消毒，变被动为主动 ，减少损失。

［1］吴 植，杜宗沛，郝福星，等.滨海地区鸡致病性大肠埃希菌的分离鉴定［J］.动物医学进展，2011，32（8）：133-136.

［2］于金玲，刘孝刚，张汉成.锦州地区鸡源大肠杆菌的分离鉴定［J］.畜牧与兽医，2011，43（2）：65-67.

［3］王 丽，刘 佳，陈克研，等.雏鸡大肠埃希菌的分离鉴定及药敏试验［J］.动物医学进展，2010，31（12）：167-171.

［4］姚火春.兽医微生物学实验指导［M］.北京：中国农业出版社，2002：36-63.

［5］刘明生，甘辉群，陆桂平，等.海安县鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定及多价灭活苗防治效果［J］.江苏农业科学，2011（6）：365-366.

［6］王永芬，席 磊.鸡致病性大肠杆菌生物学特性的相关性研究［J］.中国家禽，2008（13）：13-15.

［7］陈翠珍，姚国安，张晓君，等.肉仔鸡病原大肠杆菌地方分离株的血清型鉴定［J］.动物医学进展，2004，25（3）：109-110.

［8］吴海港，张文建，王春梅.皖北地区鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏实验［J］.中国饲料，2011（1）：11-12.

［9］王 东，王旭青，王建波，等.3株鸡大肠埃希菌地方分离株I型菌毛的免疫原性［J］.动物医学进展，2012，33（12）：16.

［10］李桂喜，闫爱萍，王珍珍.鸡源大肠埃希菌抗 “O”血清型鉴定及药敏试验研究［J］.中国动物传染病学报，2012，（6）：16.

［11］姬仲雄，高 旸.蛋鸡致病性大肠杆菌的分离及灭活苗的研制应用［J］.畜牧与兽医，2012，44（5）：75-76.

［12］张燕飞，王 东，王玉炯，等.宁夏部分地区鸡大肠埃希菌的分离与血清型鉴定［J］.动物医学进展，2012，33（5）：119-121.

［13］李惠兰，孙永祥，吴洪涛，等.辽宁省禽大肠杆菌优势血清型菌株致病性试验研究［J］.现代畜牧兽医，2012（9）：29-30.

［14］王建舫，刘兴利，刘 建，等.一株疑似外来鸡致病性大肠杆菌的分离与鉴定［J］.中国家禽，2008，30（16）：16-19.

［15］刘 华.肠出血性大肠杆菌O157∶H7病原学及流行病学特征［J］.职业与健康，2011，27（14）：1661-1663.

［16］张 芳.陕西省E.coliO157宿主动物带菌情况调查分析［J］.疾病监测，2003（11）：7.

［17］陈晓浪，成大荣，朱善元，等.鸡大肠杆菌毒力因子的流行病学及药物敏感性分析［J］.扬州大学学报：农业与生命科学版，2010（3）：1-6.

Serotype Screening and Virulence Test on Avian PathogenicE.coliin Some Areas of Shandong Province

JIA Ning1，WANG Ping2，LU Hong3，GUO Yan-yan2，YANG Chao-qun2，ZHENG Xiao-qi4，YIN Yan-bo1

（1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao，Shandong，266109，China；2.QingdaoOLand-BetterBioengineeringCo.，LTD，Qingdao，Shandong，266101，China；3.AnimalHusbandryBureauofQingdao，Qingdao，Shandong，266000，China；4.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China）

Through the collection of chicken in some areas of Shandong province，the avian pathogenicE.coliserotype distribution and pathogenic characters had been analyzed in this study.80strains ofE.coliwere isolated from 108diseased chickens and the rate of isolation was 74.0%.According to the serotype identification experiment，74strains which was characterized for O were identified and they were classified as 9serotypes，including O2，O78，O157，O35，O103，O6，O18，O178，O55.The results showed that O2，O35，O78were the predominant serotypes in Shandong province.They accounted for 61.2%of the identified strains and 56.2%of the total strains，indicating the avianE.coliin Shandong province is very complicated.

avianE.coli；pathogenicity；serotype

S852.612

A

1007-5038（2013）06-0092-04

2013-02-22

贾 宁（1987－），男，山东青岛人，硕士研究生，主要从事动物传染病防控及生物制品学研究。＊通讯作者