西府海棠花粉生活力最佳培养基的研究

2013-05-29张素华吕晓燕王奇

河南林业科技 2013年3期

关键词：西府海棠花氯化钙

张素华，吕晓燕，王奇

西府海棠花粉生活力最佳培养基的研究

张素华，吕晓燕，王奇

（漯河市园林管理处，河南 462000）

在离体培养条件下，利用正交试验设计，对西府海棠花粉萌发的最佳培养基进行了选择，通过方差分析和多重比较，试验结果表明：西府海棠花粉萌发的最佳培养基配方是蔗糖15mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+钙离子1×10-6mg·L-1。

西府海棠；花粉活力；离体萌发；最佳培养基

花粉是种子植物特有的结构，相当于一个小孢子和由它发育的前期雄配子体。根据花粉形状大小，对称性和极性，萌发孔的数目等，可以鉴定到科和属，甚至可以鉴定到植物的种[1]。它包含该物种的所有基因类型，具有丰富的遗传多样性，是种质保存和交换以及杂交育种的重要材料[2]。

花粉生活力测定可采用花粉染色测定法、花粉授粉结实检测法和花粉离体萌发测定法等[3]。花粉离体萌发一般在培养基上进行，常用的培养基基本成分是蔗糖和硼酸。其浓度一般为蔗糖10%~20%，硼酸0.001%~0.005%，pH 5.8~6.5，蔗糖的作用是提供合适的渗透压和花粉管所需能量，硼酸中的硼元素为微量元素，能促进花粉管的萌发。不同植物花粉萌发所需的培养基种类和浓度不同，二细胞型花粉较易萌发，一般在培养基上培养即可，而三细胞型花粉如菊花、水稻、甘蓝等较难萌发，要在基本培养基的基础上添加其他促进花粉萌发的因素，如Ca（NO3）2，MgSO4，PEG1261等。钙是花粉萌发所必需的，并对花粉管生长具调节作用，硼是调节花粉管生长的重要微量元素，与钙的作用密切相关。

1 本研究的目的和意义

西府海棠是山荆子（）和海棠花（）的杂交种，其树形峭立，花大，芽艳，具有较高的观赏价值，在园林中应用历史悠久，应用范围广泛[4]。西府海棠资源丰富，花量大，便于大量采集。海棠的花粉可用于任何苹果品种的人工授粉，效果与苹果混合花粉效果相当，而且海棠开花较苹果早，采粉主动，因此在花粉资源不足的情况下，可采集海棠的花粉来进行人工授粉。本研究主要针对观赏价值较高的西府海棠品种，利用悬液萌发的方法，研究花粉生活力同糖浓度、硼酸浓度、钙离子浓度的关系，以“斜枝”西府海棠花粉为材料，筛选西府海棠花粉萌发的最佳培养基。

2 材料与方法

2.1 实验材料

本试验所用花粉材料均来自植物园内生长健壮的西府海棠植株。摘取西府海棠含苞待放的花蕾，将花蕾用保鲜袋包好带回，用镊子取出花药放入培养皿中，盖上滤纸后置于阴暗处阴干花药，当花药自然裂开，花粉自然散出后将其混匀，将花粉收集后分成16等份放入已在高温高压下灭菌的指形管内备用。

2.2 实验方法

2.2.1试验仪器和试剂

试验仪器：显微镜、移液枪、滴管、培养皿、指形管、试管等。

试验试剂：蔗糖、氯化钙、硼酸等。

2.2.2试验设计

培养基选择以“斜枝”西府海棠的花粉为材料，采用3因素4水平的正交试验设计，所选择的因素水平见表1，所选择的正交见表2。每处理重复3次。

表1 培养基因素水平

表2 正交设计L16（43）

注：A-蔗糖浓度（mg·L-1）；B-硼酸浓度（mg·L-1）；C-氯化钙浓度（mg·L-1）

2.2.3花粉萌发方法

花粉离体萌发采用悬液萌发法。把培养基滴在凹玻片的凹槽内，每个凹玻片内所滴的培养基的量都是相同的，用发丝蘸取少量花粉轻轻弹入培养基表面，将发丝和镊子用酒精消毒灭菌，防止其他花粉的介入影响试验结果。再用发丝和镊子蘸取其他品种的花粉，播完花粉后贴上标签并标记培养基配方号，记录花粉接种的时间。将播有花粉的凹玻片放于有湿滤纸的培养皿中，置于25℃人工光照培养箱中培养，3 h后在10×10倍显微镜下观察各处理的花粉萌发率情况（以花粉管的长度大于花粉粒的直径作为萌发的标准[5]），隔3 h观察1次，直至其萌发率不再有显著增长为止。每次每个处理3次重复。记录每个视野的花粉总数和萌发数。

3 结果与分析

3.1 西府海棠的最佳培养基选择

在培养3 h、6 h、9 h时，观察“斜枝”西府海棠花粉萌发情况，每个处理都可使花粉萌发。3 h后观察的结果显示，16个处理的花粉萌发率增长幅度差异较大，但是处理10的花粉萌发率是最高的，其次是处理5和处理12的花粉萌发率；随着时间的延长每个处理的花粉萌发率都在增长，在培养6 h时，观察的结果表明，处理5、处理9、处理10、处理11、处理12和处理15的花粉萌发率增长速度开始有所降低，但其他处理的花粉萌发率还在继续增长；培养9 h时的观察结果显示，处理10的花粉萌发率最高，达到32.58%，其他处理的花粉萌发率几乎达到最高，不再有显著地增长，而在培养过程中，处理10的花粉萌发率一直是最高的。为分析每种因素及水平对西府海棠花粉萌发的影响，对蔗糖浓度、硼酸浓度及氯化钙浓度3因素分别进行了方差分析和多重比较，比较结果见表3至表5。

表3 “斜枝”西府海棠主效应多重比较

由表3的数据可以分析得出，蔗糖浓度为15 mg·L-1时，花粉萌发率最高，其萌发率平均值为30.10％，极显著高于蔗糖浓度为10 mg·L-1和蔗糖浓度为20 mg·L-1的花粉萌发率；蔗糖浓度为5 mg·L-1的花粉萌发率显著高于蔗糖浓度为10 mg·L-1的萌发率，极显著高于蔗糖浓度为20 mg·L-1的萌发率，但与蔗糖浓度为15 mg·L-1的萌发率差异不显著。因此，“斜枝”西府海棠花粉萌发最适合的蔗糖培养基浓度为15 mg·L-1和5 mg·L-1。

表4 “斜枝”西府海棠主效应多重比较

由表4的数据可以分析得出，“斜枝”西府海棠的花粉在不同硼酸浓度条件下，虽然在硼酸浓度为1.5 mg·L-1时，其萌发率最高，为28.00%，但各硼酸浓度之间差异不显著，这说明本试验所设计范围内的各硼酸浓度对西府海棠花粉萌发的效果是一致的。

由表5的数据可以分析得出，氯化钙浓度对西府海棠花粉萌发的影响在0.01水平上差异不显著。在0.05水平上，以氯化钙浓度1×10-6mg·L-1和 1×10-3mg·L-1时花粉萌发率最高，平均为27.9%和27.6%。氯化钙浓度为1×10-6mg·L-1和1×10-3mg·L-1时，花粉萌发率显著高于氯化钙浓度为 1×10-5mg·L-1的萌发率，但和1×10-4mg·L-1的萌发率差异不显著。当氯化钙浓度为1×10-3mg·L-1时，花粉的萌发率最低，平均为24.70%。由此可以得出在一定范围内，氯化钙浓度对西府海棠花粉萌发的影响也不是特别显著，当氯化钙浓度为1×10-6mg·L-1和1×10-3mg·L-1时，较适合西府海棠花粉萌发。

表5 “斜枝”西府海棠主效应多重比较

在选择西府海棠花粉萌发的最佳培养基时，依照以上各单因素的分析结果，最适合的蔗糖培养基浓度为15 mg·L-1和5 mg·L-1，最适合的氯化钙浓度为1×10-6mg·L-1和1×10-3mg·L-1，4个浓度的硼酸效果一致，因此最终的最佳组合数为 2×2×4个，组合数较多；又因为这样的单因素分析没有考虑各因素之间是否存在互作，为了能够筛选出适合西府海棠花粉萌发的最佳培养基，在明确各单因素对西府海棠花粉萌发影响的前提下，对正交试验中的所有16个组合的花粉萌发结果进行了方差分析和多重比较。在所观察的时间内9 h后各个处理的花粉萌发率不再有显著增长，在9 h时几乎达到最高，因此以9 h时各个处理的花粉萌发率来进行方差分析和多重比较。方差分析的结果表明蔗糖浓度、硼酸浓度和氯化钙浓度3因素存在互作，进一步的多重比较结果见表6。

表6 “斜枝”西府海棠最佳培养基选择多重比较

注：小写字母表示差异显著（a=0.05），大写表示差异极显著（a=0.01）

由表6可以看出，处理10的花粉萌发率最高，为32.58%，显著高于处理1、5和9，极显著高于处理7、8、13、14、15和16，但是和处理2、3、4、6、11和12之间没有显著差异；其次是处理12的花粉萌发率为31.60%，显著高于处理7和9，极显著高于处理8、13、14、15和16。处理12与其余的处理均差异不显著。处理3和处理6的花粉萌发率均在30%以上，显著高于处理7，极显著高于处理8、13、14、15和16。虽然处理2、3、4、6、10、11和12同属于一个水平，但是处理10的花粉萌发率最高，且显著高于处理1、5和9。处理12的花粉萌发率次之，且与处理1、5和9差异不显著，经过方差分析和多重比较可知处理10为最佳培养基，即蔗糖15 mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+钙离子1×10-6mg·L-1。

考虑互作后选择出的最佳培养基是处理10，即蔗糖15 mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+钙离子1×10-6mg·L-1。在单因素比较分析时，蔗糖15 mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+钙离子1×10-6mg·L-1也是最佳培养基组合之一，二者的分析结果是一致的。因此，确定离体培养“斜枝”西府海棠花粉的最佳培养条件为蔗糖15 mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+钙离子 1×10-6mg·L-1。