结肠康对恶唑酮诱导小鼠溃疡性结肠炎MPO、NO、iNOS的影响

关丽华， 龚玉芳， 张 弘， 商亚珍*

（1.河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德067000；2.承德医学院附属医院，河北承德 067000）

结肠康对恶唑酮诱导小鼠溃疡性结肠炎MPO、NO、iNOS的影响

关丽华1， 龚玉芳1， 张 弘2， 商亚珍1*

（1.河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德067000；2.承德医学院附属医院，河北承德 067000）

目的 观察中药复方结肠康 （黄芪、白术、茯苓、延胡索、黄连、三七等）对恶唑酮诱导小鼠溃疡性结肠炎中髓过氧化物酶 （MPO）活性、一氧化氮 （NO）水平、诱导型一氧化氮合酶 （iNOS）蛋白表达的影响，并探讨其治疗溃疡性结肠炎的作用机制。方法 小鼠颈背部3%恶唑酮致敏2 d，第6天用1.5%恶唑酮灌肠，灌肠当日开始灌胃不同剂量结肠康。灌胃3 d后，处死小鼠，测定结肠组织MPO活性和NO水平，免疫组织化学检测iNOS蛋白表达。柳氮磺胺吡啶作为阳性对照药。结果 与空白对照组相比，模型组MPO活性显著增加 （P＜0.01），NO水平、iNOS表达显著增加 （P＜0.01）；结肠康 （6.4、12.8、25.6 g/kg）组和柳氮磺胺吡啶 （0.2 g/kg）组均能显著降低MPO活性、NO水平和iNOS蛋白表达 （P＜0.01）；阳性对照药柳氮磺胺吡啶也有相似作用。结论 中药复方结肠康对恶唑酮诱导小鼠溃疡性结肠炎MPO活性、NO水平、iNOS表达有一定的影响，对溃疡性结肠炎具有一定的治疗作用。

结肠康；溃疡性结肠炎；髓过氧化物酶 （MPO）；一氧化氮 （NO）；一氧化氧合酶 （iNOS）

炎症性肠病 （Inflammatory bowel disease）是一组病因和发病机制不明的慢性肠道非特异性炎性疾病，包括克罗恩病 （Crohn's disease）和溃疡性结肠炎 （Ulcerative colitis）。其病变位于大肠，呈连续性弥漫性分布，多数累及直肠和乙状结肠。其中溃疡性结肠炎的典型临床症状包括黏液脓血便和腹痛腹泻。由于溃疡性结肠炎病变范围广泛、病情反复发作、治疗效果欠佳，病情迁延不愈，癌变可能性大，该病已被WHO确定为现代难治疾病［1］。

恶唑酮 （Oxazolone）是一种半抗原，可以在动物机体各个部位诱发接触性过敏反应。Heller等［2］研究发现，恶唑酮诱导的溃疡性结肠炎是一种IL-4介导的辅助型Th2型炎症，其肠炎模型，动物表现为懒动、体质量减轻、稀便或血便等，与溃疡性结肠炎临床过程接近［3］。国内现多采用中医或中西医结合方法治疗本病，具有临床疗效好、复发率低、不良反应少等优点［4］。中药复方结肠康是多年在临床应用治疗溃疡性结肠炎的经验方，由藿香、炒白术、茯苓、元胡、柴胡、三七粉、甘草等十九味中药组成，根据中医理论，该组方具有化湿和中、益气健脾、清热燥湿、温中涩肠、活血止痛之功效，本组方多成分、多靶点调节起效，临床观察疗效好，总有效率100%，近期治愈率50%，本方在课题组前期实验已经发现对葡聚糖和三硝基苯磺酸溃疡性结肠炎模型小鼠也具有一定的治疗作用［5-6］。本实验拟建立恶唑酮结肠炎小鼠模型，观察中药复方结肠康对恶唑酮所致小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用探讨结肠康治疗溃疡性结肠炎的可能机理。

1 材料与方法

1.1 动物 健康KM小鼠120只，7～8周，体质量22～24 g，河北医科大学实验动物中心提供 （合格证编号：1006001）。

1.2 试剂 恶唑酮购自Sigma公司，结肠康由本实验室自制，柳氮磺胺吡啶 （上海信谊嘉华药业有限公司），髓过氧化物酶 （MPO）、一氧化氮（NO）试剂盒 （南京建成生物工程研究所），诱导型一氧化氮合酶 （iNOS）抗体 （武汉博士德生物技术有限公司），免疫组化染色试剂盒 （SP-9000）（北京中杉金桥生物技术有限公司），DAB染色试剂盒 （武汉博士德生物技术有限公司）。

1.3 结肠康的配制 按结肠康中药方，总剂量210 g（三七粉除外），置于烧杯中，加适量蒸馏水浸泡30 min，煮沸后微沸30 min，滤出头煎，药渣加适量水煮沸后微沸30 min，滤出二煎，合并两次煎液静置沉淀后加热浓缩至160 mL，温度降至室温后加三七粉，研磨均匀，结肠康药液质量浓度为1.28 g/mL。结肠康12.8 g/mL剂量组小鼠用药量相当于人用药量的7.5倍，结肠康6.4 g/mL剂量组小鼠用药量相当于人用药量的3.75倍。

1.4 方法

1.4.1 小鼠结肠炎模型的建立 将120只KM小鼠分组，其中正常对照组10只，其余参考Heller等［3］方法建立恶唑酮诱导结肠炎模型：小鼠颈背部皮肤剃毛 （2 cm×2 cm），配制3% 恶唑酮（100% 乙醇溶液），取0.2 mL滴在小鼠皮肤上，自然风干，24 h后重复致敏一次。5 d后灌肠：配制1.5%恶唑酮乙醇溶液，小鼠麻醉，用硅胶管钝头插入小鼠肛门约4 cm，抽取0.15 mL 1.5%恶唑酮 （50%乙醇溶液）顺硅胶管注入小鼠肛门，速度不宜过快，完成后倒提鼠尾60 s，使溶液完全吸收，对照组同样处理，不加恶唑酮。根据小鼠毛色暗淡、体质量减轻、少食、懒动、稀便或血便判断小鼠造模成功。造模成功小鼠随机分为5个组，模型组、结肠康组 （6.4、12.8和25.6 g/kg）和柳氮磺胺吡啶组 （0.2 g/kg）。药物干预组小鼠每日灌胃给予相应药物，空白对照组和模型组灌胃给予蒸馏水，灌胃容积为0.2 mL/10 g体质量，正常饲养。

1.4.2 髓过氧化物酶 （MPO）测定 灌胃3 d后处死小鼠，取病变严重结肠固定，包埋，其余结肠组织称定质量，按1∶9生理盐水匀浆，将其加入邻连茴香胺-H2反应体系中，混匀，60℃水浴孵育10 min，通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物。取出后立即在460 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度值，从而推算出MPO的活力。酶活力单位定义：每克组织湿片在37℃反应体系中H2O2被分解1 μmol为1个酶活力单位。计算公式为：

MPO（IU/g湿片）=（测定管OD值－对照管OD值）/［11.3×取样量（g）］

1.4.3 一氧化氮 （NO）的测定 取0.5 mL组织匀浆上清置测定管，0.5mL硝酸钾标准液置标准管，0.5 mL双蒸水置空白管，试剂按说明书操作，混匀后室温静置10 min，于550 nm波长0.5 cm光径比色，分别读取各管吸光度值，计算NO水平。

计算公式：NO水平 （μmol/gprot）=（测定管吸光度 －空白管吸光度） ×标准品浓度 （20 μmol/L）/［（标准管吸光度－空白管吸光度）×样本的蛋白水平 （gprot/L）］

1.4.4 免疫组化SP法测iNOS 结肠iNOS的表达采用SP免疫组织化学法检测 （按试剂盒说明书操作）。封片后，每张切片随机选取5个高倍视野，进行阳性程度的测定，用平均吸光度值表示其强弱，若平均吸光度值高则说明其表达强，反之该值低则说明其表达弱。

1.4.5 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件包统计学处理，计算相关系数及假设t检验进行直线相关回归分析；组间多样本均数间比较采用单因素方差分析 （one-way ANOVA），P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 对结肠组织MPO活性的影响 模型组MPO活性较正常对照组显著增高129.09%（P＜0.01）；结肠康 （6.4、12.8、25.6 g/kg）组和柳氮磺胺吡啶组MPO活性较模型组显著降低为26.98%、30.16%、46.83%和42.06%（P＜0.01），且结肠康25.6 g/kg组与柳氮磺胺吡啶组比较差异无显著性 （P＞0.05），结肠康剂量与MPO水平进行直线相关 分 析，r= －0.983 9，假 设 检 验t=－11.026 5，P=0.000 4＜0.05，提示结肠康的作用呈明显剂量依赖性有效降低结肠炎所致小鼠结肠MPO活性升高 （表1）。

2.2 对结肠组织NO水平的影响 模型组NO水平较正常对照组显著增高693.33%（P＜0.01）；结肠康 （6.4、12.8和25.6 g/kg）组和柳氮磺胺吡啶组NO水平较模型组显著降低54.9%、64.99%、84.03%和81.79%（P＜0.01），且结肠康25.6 g/kg组与柳氮磺胺吡啶组比较差异无显著性 （P＞0.05），提示结肠康有效降低结肠炎所致小鼠结肠NO水平升高 （表1）。

2.3 对结肠组织iNOS蛋白表达的影响 正常对照组小鼠结肠组织仅见少量iNOS蛋白表达，模型组小鼠结肠iNOS平均吸光度值与正常对照组相比显著增高476.62% （P＜0.01）。结肠康（6.4、12.8、25.6 g/kg）组和柳氮磺胺吡啶组小鼠结肠组织iNOS的平均吸光度值较模型组显著降 低 25.21%、31.51%、74.4%和 79.82%（P＜0.01），但仍高于正常对照组，且结肠康12.8、25.6 g/kg组结肠iNOS平均吸光度值与正常对照组相比差异无统计学意义 （P＞0.05），结肠康剂量与iNOS表达进行直线相关分析，r= －0.976 9，假设检验t= －9.137，P=0.000 8＜0.05，提示结肠康的作用呈明显剂量依赖性，能有效降低结肠炎所致小鼠结肠iNOS蛋白表达升高 （图1，表1）。

表1 结肠康对恶唑酮诱导小鼠溃疡性结肠炎MPO活性、NO水平和iNOS蛋白表达的影响（n=8，±s）Tab.1 Effects of Jiechangkang on MPO activity，NO contents and the expression of iNOS of mice with experimental colitis（n=8，±s）

表1 结肠康对恶唑酮诱导小鼠溃疡性结肠炎MPO活性、NO水平和iNOS蛋白表达的影响（n=8，±s）Tab.1 Effects of Jiechangkang on MPO activity，NO contents and the expression of iNOS of mice with experimental colitis（n=8，±s）

注：与空白对照组相比，＊＊P＜0.01；与模型组相比，##P＜0.01。

分 组 MPO 活性/（IU·g－1） NO/（μmol·gprot－1） iNOS/（μmol·gprot－1）正常对照组0.55±0.16 0.45±1.05 3.55±1.06模型组 1.26±0.18＊＊ 3.57±0.94＊＊ 20.47±4.31＊＊结肠康6.4 g/kg组 0.92±0.05## 1.61±0.60## 15.31±1.75##结肠康12.8 g/kg组 0.88±0.04## 1.25±0.36## 14.02±1.04##结肠康25.6 g/kg组 0.67±0.12## 0.57±0.13## 5.24±1.91##柳氮磺胺吡啶组 0.73±0.10## 0.65±0.16## 4.13±0.95##

结果显示，正常对照组黄染颜色很淡，小鼠结肠组织仅见少量iNOS蛋白表达。模型组深色黄染，iNOS表达比正常对照组显著增高。结肠康25.6 g/kg、12.8 g/kg、6.4 g/kg组，黄染颜色逐渐变淡，iNOS蛋白表达不同程度减少。柳氮磺胺吡啶组阳性对照药物组，黄染颜色较淡，与空白对照组接近。

2.4 MPO与NO，NO与iNOS表达相关性分析MPO其水平增高可以反映中性粒细胞在某一组织中的增高，间接反映炎症在组织中的存在，MPO活性越高，说明组织炎症程度越重。本实验结果中NO与MPO活性呈正相关 （t=7.989 3，r=0.97，P=0.001 4，P＜0.05），说明NO过量生成在溃疡性结肠炎发生、发展过程中起一定作用，炎症越重，NO水平越高。iNOS与 NO水平呈正相关（t=4.332 6，r=0.908，P=0.012 3，P＜0.05），iNOS受到一定刺激后持续释放大量NO对肠黏膜有毒性损伤及促炎作用炎症程度越重，iNOS蛋白表达越多。

图1 结肠康对恶唑酮诱导小鼠溃疡性结肠炎iNOS表达的影响（×100）Fig.1 Effects of Jiechangkang on the expression of iNOS in colonic mucosa of mice with experimental colitis（×100）

3 讨论

溃疡性结肠炎的病理机制至今尚不清楚，大多研究认为众多生化介质，包括细胞因子、生长因子、NO、黏附分子等在介导这一异常的免疫反应中起着重要作用。目前认为遗传易感人群的肠黏膜免疫调节异常，持续肠道感染，肠黏膜屏障缺损和环境等因素共同参与了溃疡性结肠炎发生过程［7-8］。溃疡性结肠炎属于中医学的痢疾、泄泻、肠癖、滞下、肠风、脏毒等范畴，以腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等为主要症状，伴乏力、发热、进行性消瘦等全身症状。中医学认为其多由外感六淫之邪，内伤七情、劳倦过度及饮食不节所引起，其病因病机多由素体脾胃损伤、传导失司、郁久化热、水湿内停、湿热蕴肠、肠络受损、血腐肉败化为脓血，从而形成本虚标实、寒热错杂之证［9］。

对于炎症性肠病的常规治疗仍首先选择氨基水杨酸 （含柳氮磺胺吡啶和5-氨基水杨酸）、皮质激素、免疫抑制药物，药物的选择取决于临床治疗的目标、病变的范围、对药物的依从性和出现并发症与否［10-11］。这些药物在临床使用中发挥着重要作用，但是长期服药带来的不良反应和给患者带来的巨大的经济压力有待解决。近年来中医药治疗溃疡性结肠炎的研究日益受到重视。根据中医理论，方中黄芪、白术健脾益气、燥湿、托毒生肌，茯苓利水渗湿，一健一渗，脾可健，湿可除，湿去则脾气复来，阳气易通；元胡，入心、脾、肝、肺，是活血化瘀、行气止痛之妙品，尤以止痛之功效而著称于世；黄连清热燥湿、止痢养血，三七具有散瘀止血，消肿定痛之功效；柴胡有疏散退热，升阳，舒肝之功能。藿香性味辛、微温，入脾、胃、肺经，有芳香化湿、和中止呕、解暑发表之功，既可化在里之湿浊，又可解在表之暑湿；白芍味酸敛肝止泻，防风舒肝散脾，能散气滞。白术合甘草有理中之意；合白芍、甘草又有小建中汤温中补虚、缓急止痛之义。现代医学亦证实，白术、白芍、黄连等均有抗炎、抗病毒作用，从而有利于祛除本病的感染因素；白术能激发和提高低下的免疫功能，特别是黄连、白芍对网状内皮系统有提高其吞噬功能的作用。

MPO是中性粒细胞中的一种酶，可以通过测定MPO活性来判定中性粒细胞浸润程度，MPO活性是评价中性粒细胞在组织中浸润程度的可靠指标［11］。本实验发现，模型组MPO活性明显高于正常对照组，结肠康和柳氮磺胺吡啶则可显著降低结肠炎小鼠MPO活性，25.6 g/kg结肠康可以使其显著恢复，进一步证实结肠康对恶唑酮诱导的溃疡性结肠炎起到了一定的治疗作用。生理剂量的NO对消化系统起重要的保护作用，但是NO产生过多或胃肠道平滑肌对其敏感性增强可导致溃疡性结肠炎。NF-KB、IL-6、IL-8、IFN-γ等细胞因子能刺激炎性细胞诱导iNOS蛋白表达上调产生大量NO，参与炎症反应。NO既是免疫系统发挥作用不可缺少的调节因子，又可由于过度产生导致组织损伤。NOS是NO合成的限速酶，检测此酶可间接地反映NO的水平，iNOS主要通过生成NO而发挥其生物学作用。实验结果提示，在溃疡性结肠炎模型组iNOS表达增高，NO释放量增加，NO、iNOS与MPO活性呈正相关，通过药物治疗后，结肠康各药物治疗组和柳氮磺胺吡啶治疗组其NO、iNOS表达明显下降，结肠康的作用呈明显剂量依赖性，且其高剂量作用和柳氮磺胺吡啶无显著差别，可使之恢复到正常水平。本结果进一步证实结肠康对恶唑酮诱导的溃疡性结肠炎起到了一定的治疗作用。可以认为，NO的细胞毒作用及对免疫功能的影响与溃疡性结肠炎的发病密切相关，但是因是果，目前尚不清楚，有待进一步研究。

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Effect of Jiechangkang on MPO，NO and iNOS of colitis mice induced by oxazolone

GUAN Li-hua1， GONG Yu-fang1， ZHANG Hong2， SHANG Ya-zhen1*

（1.Hebei Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development/Institute of Traditional Chinese Medicine，Chengde Medical College，Chengde，067000，China；2.Hospital Affiliated to Chengde Medicl College，Chengde 067000，China）

AIMTo observe the effects of Jiechangkang（Astragali Radix，Atractylodis macrocephalae Rhizo-ma，Poria，Corydalis Rhizoma，Coptidis Rhizoma，Notoginseng Radix et Rhizoma，etc.）on myeloperoxidase（MPO）activity，nitric oxide（NO）level and inducible nitric oxide synthase（iNOS）protein expression of clone in oxazolone-induced ulcerative colitis mice.METHODSMice models were made by subcutaneous administration in cervix with a dose of 3%oxazolone and subsequently intragastric administration with 1.5%oxazolone on the sixth day after sensitization.Simultaneously，the oral administration began.The MPO activity and NO level were determined by spectrophotometry and the protein expression of iNOS was measured with immunohistochemistry method.Salazosulfapyridine was as positive control drug.RESULTSCompared with the control group，the MPO activity，NO level and iNOS protein expression significantly increased（P＜0.01）in colon of ulcerative colitis mice induced by oxazolone.However，the increases of MPO activity，NO level and iNOS protein expression were partly reversed by three doses of 6.4，12.8 and 25.6 g/kg Jiechangkang.Salazosulfapyridine group had the similar results.CONCLUSIONThe study reveals that Jiechangkang has certain effects on MPO，NO and iNOS，and may be helpful for treatment of ulcerative colitis.

Jiechangkang；ulcerative colitis；myeloperoxidase（MPO）；nitric oxide（NO）；inducible nitric oxide synthase（iNOS）

R285.5

A

1001-1528（2013）04-0669-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.007

2012-11-27

河北省高等学校科学技术研究青年基金项目 （2011147）

关丽华，女，硕士，讲师，主要从事中药药理学的研究。

*通信作者：商亚珍，女，研究员，主要从事中药药理学的研究。Tel：（0314）2290616，E-mail：shangyz1018@yahoo.com.cn