碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的转化①

涂晓萌，段红梅，饶家声，杨朝阳，李晓光

·基础研究·

碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的转化①

涂晓萌1，段红梅2，饶家声1，杨朝阳2，李晓光1

目的探索碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-壳聚糖载体对成年大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)向神经细胞转化的诱导作用。方法采用免疫组织化学进行定性观察，并定量计数rMSCs诱导转化为神经干细胞、神经元和星形胶质细胞等神经细胞，噻唑蓝(MTT)比色法定量检测诱导后细胞的活性。结果rMSCs经bFGF-壳聚糖载体诱导后，表达神经干细胞标记物nestin、神经元标记物β-tubulinⅢ和星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，nestin在bFGF-壳聚糖组中高表达，9 d时达到最大值49.40%。结论bFGF-壳聚糖载体可以诱导成年rMSCs高比例地分化为神经干细胞。

骨髓间充质干细胞；碱性成纤维细胞生长因子；壳聚糖；神经转化；神经干细胞；神经元；星形胶质细胞；大鼠

[本文著录格式]涂晓萌，段红梅，饶家声，等.碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的转化[J].中国康复理论与实践,2013,19(10):916-921.

中枢神经系统(central nervous system,CNS)退行性疾病或损伤后遗留的神经功能障碍严重影响患者的生活质量，其功能的修复始终是神经学科领域研究的热点。细胞移植在中枢神经系统变性疾病和损伤修复方面，有药物和其他治疗手段所达不到的疗效，引起世界各国学者越来越多的关注[1]。干细胞因其具有高度自我更新和多向分化潜能性，是细胞移植的首选细胞。所以移植外源性干细胞重塑神经组织是治疗中枢神经系统疾病的一种重要策略。然而干细胞的研究面临着一些问题，如干细胞研究的技术问题：如何定向诱导干细胞分化；如何克服移植排斥反应；如何避免形成肿瘤；还有伦理学问题等。

大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rMSCs)是一种存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群，在一些化学物质或细胞因子的作用下，不仅能够分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌细胞等中胚层细胞，而且可以跨越胚层的限制，横向分化为外胚层起源的神经元和星形胶质细胞，所以具有干细胞的两个重要特征：自我更新和多向分化潜能[2]。rMSCs与其他干细胞相比具有来源丰富、容易分离、自体移植没有免疫排斥反应和不存在伦理问题等优势。

2011年，Ding等通过细胞重组技术，对现有的诱导多功能干细胞(iPS细胞)技术进行改进，将成人皮肤细胞直接转化成神经干细胞(NSC)，所得到的神经干细胞是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞[3]。目前，研究者绝大多数采用的诱导方法是在含有2%N2/B27的神经基础培养基中添加表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)直接体外诱导rMSCs转化为神经干细胞[4-6]。

本实验室前期研究发现，bFGF-壳聚糖载体能成功诱导7 d乳鼠的骨髓间充质干细胞高比例分化为神经元，高达83.54%，同时发现此过程中有神经干细胞的标记物nestin的表达[7]，在此基础上，我们使用成年大鼠的骨髓间充质干细胞，探索其经bFGF-壳聚糖载体的诱导后，定向转化为神经干细胞的潜能及诱导产生的细胞类型,并通过神经细胞的形态和神经细胞的标记物进行验证，同时对比使用成年和7 d乳鼠骨髓间充质干细胞诱导结果。

1材料和方法

1.1实验材料

成年Wistar大鼠，200～220 g，由首都医科大学实验动物中心提供。试剂：α-MEM培养基(Applichem)、nestin小鼠单克隆抗体(Chemicon,CA)、β-tubulinⅢ兔单克隆抗体(Chemicon,CA)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)兔单克隆抗体(Chemicon,CA)和四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(SIGMA)。

1.2 rMSCs的分离培养

用6%的水合氯醛0.006 ml/g麻醉大鼠，75%医用酒精消毒，冰上解剖后肢；在不破坏股骨和胫骨的情况下，分离股骨和胫骨；使用PBS(0.01 mol/L)冲洗3遍；将股骨和胫骨放入含10%胎牛血清(澳洲.excell)的α-MEM培养基中，无菌注射器彻底冲洗骨髓腔；反复冲打骨髓细胞，使之成为单细胞悬液；按照1∶1比例，将骨髓细胞悬液加在淋巴细胞分离液之上，1000 r/min，离心10 min；取沉淀细胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培养基吹散为单个细胞；以(1～3)× 106/ml的浓度接种到含10%胎牛血清的α-MEM培养液的塑料培养皿中，在37℃5%CO2饱和湿度培养箱内孵育；24 h后全量换液，每3天全量换液1次；连续培养7 d后,当基质细胞长满培养皿80%时，用0.25%胰酶+乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)消化细胞，传代培养。

1.3 rMSCs的鉴定

rMSCs在连续培养到3代后对其进行鉴定。用0.25%胰酶+EDTA从培养皿底部消化贴壁的rMSCs；4℃、1000 r/min离心5 min，弃上清；然后用PBS冲洗，4℃、1000 r/min离心5 min，弃上清；重复一次；保留约200 μl的PBS溶液，分别用PE-Cy5标记的小鼠抗大鼠的CD45单克隆抗体(BD Pharmingen)和FITC标记的小鼠抗大鼠的CD90(BD Pharmingen)单克隆抗体双标、FITC标记的小鼠抗大鼠的CD44单克隆抗体(BD Pharmingen)和PE-Cy5标记的小鼠抗大鼠的CD45单克隆抗体双标；冰上放置30 min后，用流式细胞仪(COULTER EPICS@XL,America)进行检测。

1.4 rMSCs的诱导分化

将传代3次以上的rMSCs的细胞培养于铺有多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板内，接种密度为(1～3)× 107/ml，分别加入不同的诱导剂：实验组1：单纯壳聚糖(4 mg/ml)；实验组2：单纯bFGF(25 ng/ml)；实验组3：bFGF-壳聚糖(4 mg/ml)；对照组：仅含有5 ml α-MEM培养基，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内孵育，每隔3 d半量换液1次，连续培养1个月。

1.5免疫荧光染色

以上各组的细胞在诱导后3 d、5 d、7 d、14 d后，吸出培养基，PBS洗3次，每次5 min；4%多聚甲醛，4℃固定40 min，PBS洗3次，每次5 min；0.2%PBST浸泡5 min，1%羊血清(0.2%PBST配制)在37℃封闭30 min；加入一抗：nestin(1∶100)，β-tubulinⅢ(1∶100)，GFAP(1∶50)，在37℃下孵育120 min；PBS洗3遍，每次5 min；加入荧光二抗(1∶100)，37℃避光孵育50 min，PBS洗3次，每次5 min，Hochest染核(1∶1500)，室温下5 min，去离子水漂洗3次，每次5 min，封片观察。

1.6细胞活性的检测

在96孔板中每个孔内加入200 μl细胞悬液，接种密度为5×104个；实验分组：单纯壳聚糖组(4 mg/ ml)、单纯bFGF组(25 ng/ml)、bFGF-壳聚糖组(4 mg/ ml)和单纯培养基组。每组6个重复样本，细胞每3天半量换液1次。细胞在诱导1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d后，每孔加入0.1 mmol/L MTT 10 μl，培养箱中孵育4 h后，吸去上清，每孔内加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μl，振荡10 min，酶标仪570 nm检测吸光值。

1.7统计学分析

采用SPSS 18.0进行统计学分析。采用Levene's test确定数据是否为正态分布，然后采用单因素方差分析进行总体差异的分析，采用Bonferroni分析法进行两两组间的比较。显著性水平α=0.05。

2结果

2.1 rMSCs鉴定

大多数细胞呈扁平形、梭形、三角形，为典型的rMSC的形状(图1)。流式细胞术实验重复3次，平均91%的细胞为CD44+/CD45-；平均97%细胞是CD45-/ CD90+，这说明从成年大鼠股骨和胫骨的髓腔内提取的细胞，经过3～6次传代培养后，90%以上的细胞为rMSCs。见图2、图3。

图1 rMSCs传代3代后的形态(相差显微镜20×10×1.6)

2.2光镜下结果

在特定的时间点，我们观察rMSCs在无血清条件下，在3组培养体系中的行为变化。

单纯bFGF组：培养1 d后，没有观察到球状细胞。随着培养时间的延长，球状细胞极少。

单纯壳聚糖组：培养前3 d内，有小的细胞球产生，培养1周后，球状细胞数目增加并且伸出细而短的突起。

bFGF-壳聚糖组：培养1 d后，球状细胞产生，1周后，球状细胞数目显著增加，且大量的细而短的突起产生。见图4。

图2 rMSCs传3代后表面标记(CD45、CD44双标)鉴定

2.3免疫荧光染色

3 d时对单纯bFGF组、单纯壳聚糖组和bFGF-壳聚糖组进行免疫组化染色，3组中未成熟神经元的标记物β-tubulinⅢ和神经干细胞的标记物nestin均表达，单纯bFGF组中nestin和β-tubulinⅢ表达量高于其他两组。见图5。星形胶质细胞标记物GFAP在单纯bFGF组和bFGF-壳聚糖组中表达，在单纯壳聚糖组中极少。见图6。

7 d时，3组中β-tubulinⅢ和nestin均表达；bFGF-壳聚糖组中nestin和β-tubulinⅢ表达量高于其他两组，GFAP在3组中极少。见图7。9 d时，bFGF-壳聚糖组中nestin和β-tubulinⅢ持续高表达。见图8。

图5～图9表明rMSCs诱导初期可以产生未成熟神经元、星形胶质细胞和神经干细胞，随着诱导时间的延长，未成熟细胞、星形胶质细胞和神经干细胞在bFGF-壳聚糖组中持续高表达。

2.4细胞活性的检测

4组细胞在诱导1 d后，细胞活性无显著性差异(P＞0.05)。随着诱导时间的延长，3 d、7 d、14 d、21 d后，bFGF-壳聚糖载体组细胞活性明显高于单纯壳聚糖组、单纯bFGF组和对照组(P＜0.05)；诱导3 d、7 d后，单纯bFGF组细胞活性明显高于单纯壳聚糖组和对照组(P＜0.05)。诱导28 d后4组细胞的细胞活性无显著性差异(P＞0.05)。整个诱导过程中单纯壳聚糖组和对照组之间无显著性差异(P＞0.05)。见图10。

图3 rMSCs传3代后表面标记(CD45、CD90双标)鉴定

图4 rMSCs各组诱导7 d后的状态(相差显微镜，40×10×1.6)

图5 各组诱导3 d免疫荧光染色(荧光显微镜，20×10×1.6 红色：nestin；绿色：β-tubulinⅢ)

图6 bFGF-壳聚糖组3 d免疫荧光染色(荧光显微镜)

图7 各组诱导7 d免疫荧光染色(荧光显微镜，红色：nestin；绿色：β-tubulinⅢ)

图8 bFGF-壳聚糖组9 d免疫荧光染色(荧光显微镜)

图9 bFGF-壳聚糖组不同时间nestin阳性细胞百分率

图10 rMSCs在诱导不同时间后各组细胞的活性

3讨论

rMSCs是一类存在于骨髓基质中的成体干细胞，参与骨髓微环境的形成，具有向中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的潜能。由于rMSCs缺乏特异性表面抗原标志分子，因此通常以细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105等阳性标志，以及CD34、CD45等阴性标志作为鉴别指标[8-9]。自体MSCs的数量和功能受年龄、疾病等因素的影响，体外扩增时间长。rMSCs具有多向分化潜能，低免疫原性，同种异体移植后能够调节机体免疫，因此逐渐成为再生医学和免疫学研究的热点[10-12]。

目前，测定细胞活性、检测生物材料的生物相容性和细胞毒性常用的一种实验方法是MTT比色法[13]。将壳聚糖和rMSCs共培养，可研究壳聚糖载体是否对干细胞具有细胞毒性和诱导作用。结合乳鼠的骨髓间充质干细胞的MTT实验结果，发现单纯壳聚糖对不同来源的干细胞均无细胞毒性,也不会抑制它们的分化，具有很好的生物相容性。

比较bFGF-壳聚糖载体诱导7 d乳鼠的rMSCs分化的结果发现，两种来源的rMSCs均可向神经元转化，且诱导比例均要明显高于单纯bFGF组和单纯壳聚糖组[7]。同时，在诱导过程中，成年的rMSCs可转化为神经干细胞，bFGF-壳聚糖载体组神经干细胞的比例可高达49.4%，明显高于单纯bFGF组和单纯壳聚糖组。随着诱导时间的延长，神经元为存在的主要细胞类型，其起来源可有两种途径，一种由rMSCs直接分化为神经元，另一种由rMSCs先转化为神经干细胞，神经干细胞再分化为神经元。

移植NSC为中枢神经系统损伤等治疗提供了一个颇具前景的新途径，但获得NSCs受到取材困难及伦理学等方面的限制，目前的研究多集中在纹状体和皮层的NSC上，很难广泛应用于临床[14]。而本实验中成年rMSCs转化为NSC，而不是使用幼年的rMSCs，其应用更为广泛，为NSC移植提供新的种子来源，这样将能克服从脑组织获取NSCs的危险性和局限性，同时又可避免胎儿脑组织移植存在的伦理和免疫排斥问题，有可能解决中枢神经系统损伤等疾病的临床个体化治疗问题，具有很大的应用价值。

之前研究证明25 ng/ml的bFGF是体外NSC生长的最适宜的浓度[15]。因此，在我们的研究中，每10 mg的壳聚糖载体结合bFGF 10 ng，制成bFGF-壳聚糖载体，每1 ml培养基中一次性加入壳聚糖载体10 mg，用来观察壳聚糖载体结合的bFGF的作用效果。前期研究证明神经营养因子与生物材料基质结合后，既可以提高神经营养因子的作用效率，同时也可以延长神经营养因子的作用时间[16]。

调研bFGF能诱导MSCs的神经分化发现，利用DNA测序方法检出MSCs表面存在FGF受体[17]。FGF作用于MSCs时,可以与MSCs的表面受体结合，进一步激活一系列的胞内反应，促使rMSCs向神经细胞分化。激活的bFGF受体，将信号传到胞内，通过Ras/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，完成细胞外信息向细胞内传递而发挥其生物学活性作用[18]。然而，具体的转化机制仍需要进一步研究证明。

本实验bFGF-壳聚糖载体诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞直接转化为NSC提供依据。接下来需阐明bFGF-壳聚糖载体作用下的MSCs向NSC的转化过程的机制。

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Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells'Transformation into Nerve Cells Induced by Basic Fibroblast Growth Factor-Chitosan Carrier

TU Xiao-meng,DUAN Hong-mei,RAO Jia-sheng,et al.School of Biological and Medical Engineering,Beijing Institute of Technology,Beijing 100191,China

ObjectiveTo explore the induction of basic fibroblast growth factor(bFGF)-chitosan carrier transforming the adult rat bone marrow mesenchymal stem cells(rMSCs)into nerve cells.MethodsrMSCs were detected qualitatively and counted quantitatively by immunohistochemistry after they were induced into nerve cells,such as neural stem cells neurons and astrocytes.The methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)chromometry assay was carried out to determine the cell viability.ResultsrMSCs induced by bFGF-chitosan carrier expressed neural stem cell marker nestin,neuron marker β-tubulinⅢand astrocytes marker glial fibrillary acidic protein(GFAP).Nestin expressed more in the bFGF-chitosan group,and reached its maximum(49.40%)at the 9th day.ConclusionbFGF-chitosan carrier can induce the adult rMSCs differentiate into neural stem cells in a high proportion.

bone marrow mesenchymal stem cell;basic fibroblast growth factor;chitosan;nerve transformation;neural stem cells;neurons;astrocytes;rats

R329.2

A

1006-9771(2013)10-0916-06

2012-10-22

2013-08-22)

1.北京市科委重点项目(No.D09080104660000)；2.国家自然基金重点项目(No.31130022)；3.国家科技支撑计划(No. 2012BAI17B04)；4.国家“863”计划(No.2012AA020506)。

1.北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京市100191；2.首都医科大学神经生物学系，北京市100069。作者简介：涂晓萌(1987-)，女，河南项城市人，硕士研究生，主要研究方向：应用组织工程学方法修复神经系统损伤的研究。通讯作者：李晓光(1959-)，男，汉族，吉林长春市人，博士，教授，主要研究方向：应用组织工程学方法修复神经系统损伤的研究。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.10.005