一步阳离子柱层析高效纯化溶菌酶及其溶菌活性Δ

2013-05-22赵林蔡金艳周林李黄金周联广东药学院生命科学与生物制药学院广州50006广州中医药大学临床药理研究所广州50405广东药学院药科学院广州50006

中国药房 2013年1期

赵林，蔡金艳，周林，李黄金，周联（.广东药学院生命科学与生物制药学院，广州 50006；2.广州中医药大学临床药理研究所，广州 50405；.广东药学院药科学院，广州 50006）

溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，其作用于N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，可使革兰阳性菌细胞壁中黏多糖成分分解[1]，因而具有杀菌能力，在医学上具有重要的应用价值。其可用于制备抗菌消炎药、抗病毒药，与抗菌药物合用可以治疗溃疡、口腔和鼻腔黏膜炎，另还具有抗肿瘤、增强免疫力的药理作用[2-4]。虽已应用多年，至今仍未出现耐药现象[5]。在全球耐药菌引起的疾病不断爆发的情况下，溶菌酶的研究和应用越来越多地受到人们的关注。

溶菌酶广泛存在于动植物体内和人的正常体液中，其中鸡蛋清溶菌酶含量最丰富。目前溶菌酶纯化方法主要有结晶、盐析、超滤、离子交换层析法等。结晶法操作简单、成本低，但耗时长，酶的粗制和精制分别需要1周和1月以上的时间[6]；盐析法只能得到一定纯度的产物，酶比活力不高，只有13000 U/mg[7]；超滤法工艺简单，但滤膜容易堵塞，收率一般在50%左右[8]；层析法是获得高纯度溶菌酶的理想方法，应用较多的是阳离子交换层析法。在相关的层析研究中[9-12]，研究者较多采用静态吸附、洗脱溶菌酶，操作繁琐、耗时长，酶的吸附及杂质的去除效率都有待提高。本研究采用等电点沉淀结合一步阳离子交换柱层析来探索溶菌酶的高效分离纯化工艺，为其实验室制备和工业生产提供依据。

1 材料

SORVALL D-37520高速离心机（德国科竣公司）；DWD-1紫外检测仪、FB-2型恒流泵（上海金达生化仪器公司）；Z型层析柱（上海锦华层析设备厂）；Tanon 1220凝胶成像系统（上海天能有限公司）；Alpha1-2冻干机（德国CHRIST公司）；BCM-100生物洁净工作台（苏州净化设备有限公司）；Ultro-spec 1100 pro分光光度计（美国GE公司）；AUW120分析天平（日本岛津公司）。

新鲜鸡蛋（市售）；阳离子交换剂羧甲基-琼脂糖凝胶（CM-Sepharose FF，美国GE公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、溴酚蓝、溶菌酶标准品（批号:080622，比活力:20000 U/mg）均为广州威佳科技有限公司产品；蛋白质低分子质量标准[宝生物工程（大连）有限公司，批号:D530A，分子质量范围:14～97 kD]；蛋白胨、酵母粉（英国OXOID公司）；NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH、HCl、甘油均为分析纯。

溶壁微球菌（广东省微生物研究所）。

2 方法与结果

2.1 稀释及等电点沉淀处理蛋清

取新鲜鸡蛋，破壳取蛋清置于250 ml的烧杯中，加入3倍体积的0.02 mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液（PBS，以下浓度和pH均相同）搅拌均匀。用1 mol/L HCl调节pH值至4.7，12000 r/min离心5 min。上清转移至另一干净烧杯中，用1 mol/L NaOH调节pH值至8.0，再次12000 r/min离心5 min。弃掉沉淀，上清经孔径为0.20 μm的微孔滤膜过滤，滤液留用。由于蛋清中主要杂蛋白卵清蛋白的等电点为4.7，类卵黏蛋白的等电点为4.8，pH调节为4.7时形成了大量的絮状白色沉淀，经离心除去。在pH值回调为8.0的过程中，由于杂蛋白卵转铁蛋白的等电点为6.6，又出现了絮状沉淀，再离心除去。最后经稀释、2次沉淀和离心、微滤处理，部分杂蛋白被除去，获得的滤液均一、澄清，黏度大大降低，保证了下一步柱层析动态上样的顺利进行。目标产物溶菌酶留在滤液中，在pH值为8.0的条件下带正电荷，而其他杂蛋白带负电荷，为离子交换层析分离创造了条件。

2.2 利用阳离子交换剂CM-Sepharose FF柱层析纯化溶菌酶

采用重力沉降法将20 ml CM-Sepharose FF阳离子交换剂均匀地装入层析柱中。连接好蠕动泵、监测器、记录仪，用3倍柱床体积（CV）的PBS过柱平衡，流速为2 ml/min。待PBS剩余约5 ml时，将监测器吸收信号调零，之后继续平衡。平衡完毕，将“2.1”项中处理好的滤液以相同的速度上样，结束后以2倍CV的PBS清洗。用A液（即PBS）和B液（含0.5 mol/L Na-Cl的PBS）各100 ml进行线性梯度洗脱，准确收集洗脱峰样品。取0.5 ml测定纯度，其余样品进行低温冷冻干燥，称量所获得的白色粉末。层析结果见图1。

由图1可以看出，基线平稳，柱平衡良好。上样和清洗过程所形成的穿透峰（峰1）典型，溶菌酶与交换剂的交换平稳顺畅，无过载；上样完毕洗涤信号较易回到基线。之后采用盐溶液梯度洗脱，只得到1个对称狭窄的洗脱峰（峰2），表明柱效较高，样品可能只含有单一成分，纯度较高。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）测定溶菌酶纯度

图1 阳离子交换纯化溶菌酶层析图1.穿透峰；2.洗脱峰Fig 1 Cation-exchange chromatography process of lysozyme purification1.unbound fraction peak；2.elution fraction peak

图2 SDS-PAGE检测溶菌酶纯度M.蛋白质低分子量标准；1.洗脱峰样品；2.溶菌酶标准品Fig 2 SDS-PAGE analysis of purified lysozymeM.low molecular mass protein marker；1.sample of elution fraction peak；2.standard lysozyme

制备12%的分离胶、5%的浓缩胶，将离子交换洗脱峰样品与溶菌酶标准品分别加入等体积的2倍蛋白上样缓冲液，100℃水浴5 min，冷却后各取10 μl上样电泳。起始以20 mA的恒定电流进行电泳，当溴酚蓝进入分离胶界面时，调整电流为30 mA继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底端。剥胶，进行考马斯亮蓝染色和脱色。脱色干净后，利用凝胶成像系统拍照，照片经系统自带的GIS 1D软件分析条带的光密度值和光密度百分比，从而间接反映样品的纯度。SDS-PAGE检测溶菌酶纯度结果见图2。

由图2可知，离子交换洗脱峰样品经电泳后只出现了1条清晰的条带，与溶菌酶标准品比较，均处于14 kD大小的位置上，证明该蛋白质为蛋清溶菌酶。其纯度经GIS 1D软件扫描分析，结果约在95%以上。洗脱峰样品经低温冷冻干燥后获得237.9 mg溶菌酶粉末，所用蛋清为56.7 ml，折合收率为4.2 mg（溶菌酶）/ml（蛋清）。

2.4 溶壁浊度法检测溶菌酶溶菌活性

以1%的接种量将溶壁微球菌接种在50 ml灭菌的LB培养基中，摇床（180 r/min）、37℃培养过夜。4000 r/min离心10 min，弃上清收集菌体。用100 ml、0.02 mol/L、pH 6.2的PBS悬浮菌体，4000 r/min离心10 min，弃上清，重复洗涤1次。之后用0.02 mol/L、pH 6.2的PBS悬浮菌体，调整450 nm波长处的吸光度值（A450）为0.6左右。称取1 mg纯化后冻干的溶菌酶粉末，用0.02 mol/L、pH 6.2的PBS制备成50 μg/ml的样品溶液。取0.1 ml此样品溶液和2.9 ml的细胞悬液置于比色杯中，以0.02 mol/L、pH 6.2的PBS调零，测量1 min内A450的下降值。

溶菌酶的活力单位规定为:25℃和pH 6.2的条件下，每分钟使溶壁微球菌的A450下降0.001的酶量即为1个酶活力单位（1 U）。计算公式:酶活力（U）＝（A1－A2）/0.001。其中，A1表示450 nm波长下起始的吸光度值；A2表示450 nm波长下反应1 min后的吸光度值；酶活力（U）为参与反应的酶液所含有的总活力单位数。溶菌酶的比活力＝酶活力（U）/酶的质量（mg）。

活性检测结果显示，A1＝0.572，A2＝0.484，经计算0.1 ml的样品溶液总活力单位为88 U。根据其质量浓度50 μg/ml可计算出0.1 ml样品中溶菌酶样品的质量为0.005 mg，结合比活力的计算公式，可算出纯化的溶菌酶样品的比活力为17600 U/mg。

3 讨论

生物分离技术研究的根本任务是设计和优化分离过程，提高分离效率，减少分离过程步骤，缩短分离操作时间，达到提高产品收率与活性、降低生产成本的目的。在溶菌酶的众多分离方法中，存在着步骤多、效率低的问题，有必要进一步改进。层析作为一种高精度的分离纯化手段，在生化药物、基因工程重组蛋白、重组核酸等的分离纯化中占据着核心的位置。层析前的预处理和层析介质的选择、pH值、洗脱条件等是影响层析纯化效率的重要因素。

本研究从鸡蛋清中分离纯化溶菌酶，在蛋清中除了目的蛋白溶菌酶外，还包括卵清蛋白、卵转铁蛋白、类卵黏蛋白、卵黏蛋白4种主要杂蛋白。卵清蛋白占了蛋白质总量的56.80%，其等电点为4.7；卵转铁蛋白占了13.70%，其等电点为6.6；类卵黏蛋白占了11.60%，其等电点为4.8；卵黏蛋白占3.15%，其等电点介于3.83～4.41间；而溶菌酶占蛋白质总量的3.50%，等电点为10.8，且在较宽的pH值范围内稳定，尤其是在碱性环境中更稳定[13]。等电点的差异是目标蛋白与杂蛋白区别的一个重要方面，杂蛋白的等电点主要处于酸性pH值范围内，目标蛋白的等电点处于碱性pH值范围内。因此从等电点出发，先利用等电点沉淀，去除一部分杂质进行预处理，再结合一定pH值下电荷的差异，利用离子交换层析来精制纯化，理论上应该可以得到高收率、高纯度、高活性的溶菌酶。

试验中将蛋清稀释液的pH值调整到4.7，主要杂蛋白卵清蛋白和类卵黏蛋白被部分沉淀，之后高速离心去除。此步骤大大降低了样品的黏度，减轻了柱层析的负担，而溶菌酶由于其特殊的稳定性几乎没有损失，达到了预处理的目的。

离子交换层析是层析分离中最常用的方法之一。为保持高的生物活性，往往采用弱阳离子或弱阴离子交换。CM-Sepharose FF为GE公司生产的一种弱阳离子交换介质，分辨率高、线型流速快、与物质结合后易被重新分开，常适合于生物活性物质的分离。研究中采用0.02 mol/L、pH为8.0的PBS来处理蛋清、平衡柱床并作为洗脱的基础缓冲液，不仅可以保证溶菌酶的活性，而且可以使目标成分和杂质成分均带上较多的相反电荷（其中溶菌酶带上正电荷，其他杂蛋白带上负电荷）。这样经一步CM-Sepharose FF阳离子柱层析就可以获得高纯度的溶菌酶。层析图验证了这种情况:上样时穿透较多且平稳，梯度洗脱时只出现1个对称且尖锐的洗脱峰，说明分辨率是较高的。SDS-PAGE结果证明该洗脱峰样品纯度达到了95%以上。由于纯度较高，酶的比活力达到17600 U/mg的水平。整个纯化过程只涉及到等电点沉淀和离子交换柱层析，溶菌酶损失很少，收率达到4.2 mg（溶菌酶）/ml（蛋清）的水平，比余海芬等报道[11]的3.0 mg/ml的收率高40%；且整个分离过程只需约2 h，简洁高效，达到了缩短分离操作时间、提高产品收率与活性、优化分离过程的目的。

综上所述，本研究选择CM-Sepharose FF为交换介质，将蛋清稀释并等电点沉淀后，经一步柱层析，简洁高效地分离得到了高活性的溶菌酶，可为实验室制备及工业生产提供有效方法。

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