药物在体内分布及肝靶向性研究

2013-05-14郭影坤

当代化工 2013年3期

郭影坤，隋阳

（东北制药集团供销有限公司，辽宁沈阳 110023）

齐墩果酸（OA）分子式为 C30H48O3，临床用于治疗慢性病毒性肝炎，对症状、体征和肝功能均有明显的改善作用[1]，还能明显降低高龄鼠脑、肝中的过氧化脂质含量，提高肝中超氧化物歧化酶（SOD）活性，具有抗衰老的作用[2]。纳米粒（NPs）是一种毒性小、稳定性好的靶向制剂，经静脉注射入血后能够将包裹的药物浓集于肝、脾，降低了药物在其他组织中的分布。聚乙二醇1 000维生素E琥珀酸酯（TPGS）是维生素E的水溶性衍生物，广泛应用于制剂研究中，作为增溶剂、吸收促进剂、乳化剂、增塑剂以及脂溶性药物传递系统的载体，同时具有肝细胞特异性识别的作用[3]。乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种生物可降解性合成高分子材料[4]，而本试验采用的是将TPGS和PLGA合成的新型载体材料—乳酸羟基乙酸共聚物-水溶性维生素 E（PLGA-TPGS），不但可通过控制纳米粒的大小，实现齐墩果酸对肝脏的被动靶向作用，同时由于TPGS具有肝细胞特异性识别的作用，可使纳米粒又具有对肝脏的主动靶向作用，可增强齐墩果酸在靶位的活性、作用时间，减少给药量以及在非靶部位的聚集和毒副作用，使齐墩果酸能更好的发挥作用。

1 实验部分

1.1 药品和试剂

齐墩果酸对照品、齐墩果酸、水溶性维生素E、乳酸羟基乙酸共聚物、乳酸羟基乙酸共聚物-水溶性维生素E、冰醋酸、甲醇、甲基叔丁基醚、实验用水均为去离子双蒸水。

1.2 仪器

1100型高效液相色谱仪、FA1104I上皿电子天平、BF-2000 氮气吹干仪、XW-80A漩涡混合器、TGL-16C高速台式离心机、IKAT-10组织分散机。

2 方法和结果

2.1 RP-HPLC条件和行为

色谱柱为 HYPERSIL C18；流动相为甲醇:0.03%醋酸溶液（90:10）；流速为1.0 mL•min-1；检测波长为210 nm[7]，柱温为20 ℃，进样量为10 μL。齐墩果酸（OA）色谱峰与其他组分峰能达到基线分离，OA的保留时间约12.7 min，理论板数按齐墩果酸峰计算不低于4 000。

2.2 齐墩果酸纳米粒的制备工艺

取齐墩果酸样品30 mg置10 mL离心管中，再乳酸羟基乙酸共聚物-水溶性维生素 E100 mg置离心管中，加入8 mL乙酸乙酯，量取0.03%TPGS水溶液 120 mL置 250 mL烧杯中，加入 OA和PLGA-TPGS的乙酸乙酯溶液，超声 12 min，525 r•min-1电动搅拌 12 h，16 000 r•min-1高速离心 15 min，洗3次，冷冻干燥24 h，得OA -NPs。

2.3 RP-HPLC法测定

2.3.1 OA对照品溶液的配制

称取OA对照品50.0 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇制浓度为 500 µg•mL-1的对照品贮备液。分别精密量取OA对照品贮备液配成6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μg•mL-1系列浓度对照贮备液。

2.3.2 生物样品的预处理

小鼠从眼静脉丛取血，处死后取出肝、心、脾、肺、肾等脏器，加2倍量生理盐水制成匀浆。分别取血清和各脏器匀浆0.1 mL，用甲基叔丁基醚提取取有机层用氮气流吹干，最后加入 100 μL甲醇漩涡，取20 μL进样。

2.3.3 标准曲线的绘制

分别取空白血清和各脏器匀浆0.1 mL，加入0.1 mL不同浓度的OA对照贮备液，再加入甲基叔丁基醚1.0 mL，提取两次[5]，取有机层氮气流吹干，最后加入100 μL甲醇振荡溶解，取20 μL进样，HPLC法测定。以OA峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归，得血清和各脏器匀浆的标准曲线，分别为：血清：A=2950.3C–1967.6，r=0.9989；心匀浆：A=3693.5C+27372，r=0.9912；肝匀浆：A=3693.5C+27372，r=0.9901；脾匀浆：A=5365.5C–29533， r=0.9962；肺匀浆：A=10227C-42762，r=0.9784；肾匀浆：A=4661C–35401，r=0.9910。结果表明，OA 在 6.25～100.0 μg•mL-1范围内线性关系良好， OA最低检测浓度为 1 μg•mL-1。

2.3.4 加样回收试验

分别取空白血清或脏器匀浆0.1 mL，分别精密加入6.25、25、100 μg•mL-1的OA对照品溶液0.1 mL，配制成低、中、高3个浓度测定血清及各组织样品中OA的回收率，测定峰面积（A），各样品平行操作6份。根据标准曲线计算含量，以测得量与加入量比较，计算血清和各脏器的回收率见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Table 1 Recovery test results（n=6）

表明此法用于测定样品含量的准确度好。

2.3.5 精密度试验

取空白血清和脏器匀浆0.1 mL，分别加入12.5、25、100 μg•mL-1的 OA 对照品溶液 0.1 mL，每天在同一时间进样连续测定5 d，分别测定OA对照贮备液的日内精密度和日间精密度见表2。

表2 精密度试验结果（n=6）Table 2 The results of precision test（n=6）

结果RSD值均＜3%，表明取样精密度良好。

2.4 OA-NPs在小鼠体内的分布和肝靶向性测定

2.4.1 小鼠给药方案

取小鼠120只，随机分为12组，每组10只。其中6组OA-NPs组，6组为OA-SOLs组。禁食12 h后按20 mg•kg-1剂量尾静脉注射给药。分别于药后的5、30、60、120、240、480 min处理一组。

2.4.2 OA在血清和各脏器中的浓度值

OA-NPs经小鼠尾静脉注射后各时间点血和各器官中药物浓度值见表3和图1；OA-SOLs经小鼠尾静脉注射后各时间点血和各器官中药物浓度值见表4和图2；OA-NPs和OA-SOLs在肝中60 min时的药物浓度比较见图3。

表3 OA-NPs小鼠尾静脉注射后各时间点血清和各器官中药物浓度(n=10)Table 3 Drug concentration(n=10)in serum and various organs at different time points after OA-NPs mouse tail vein injection μg•mL-1

图1 OA-NPs静脉注射后血清和各器官中药物浓度-时间曲线图Fig.1 The curve of drug concentration and time in serum and various organs after OA-NPs intravenous injection

图2 OA-SOLs静脉注射后血清和各器官中药物浓度-时间曲线图Fig. 2 The curve of drug concentration and time in serum and various organs after OA-SOLs intravenous injection

表4 OA-SOLs小鼠尾静脉注射后各时间点血清和各器官中药物浓度(μg•mL-1，n=10)Table 4 Drug concentrations in serum and various organs at different time points after OA-SOLs mouse tail vein injection(μg•mL-1 ，n=10)

2.4.3 OA-NPs靶向指数和选择性指数

靶向指数（TI）是指给予实验动物载药纳米粒和游离药物后，靶器官（肝脏）药物浓度之比；选择性指数（SI）是指给予实验动物载药纳米粒后，靶器官（肝脏）药物浓度与血清中药物浓度之比。根据表3和表4可得出各时间点载药纳米粒和游离药物在肝脏的TI和SI值，结果见表5。

表5 OA-NPs尾静脉注射后各时间点的TI和SI值Table 5 TI and SI values at different time points after OA-NPs tail vein injection

OA-NPs经尾静脉注射后均具有较好的肝靶向性。

图3 OA-NPs 和OA-SOLs静脉注射60 min后血清和各器官中药物浓度图Fig.3 Drug concentration diagram in serum and various organs at 60 min after OA-NPs and OA-SOLs intravenous injection

2.4.4 相对靶向效率

相对靶向效率（Re）是指给予实验动物载药纳米粒和游离药物后，各器官AUC之比,即Re =AUC OA-NPs /AUC OA-SOLs。OA-NPs和 OA-SOLs经尾静脉注射后各组织AUC和Re值见表6。

表6 OA在血清和各器官的AUCTable 6 AUC of OA in the serum and various organs

结果肝脏的Re值最大，表明OA-NPs具有较大的肝靶向性。

2.4.5 靶向效率

靶向效率（Te）是指给予实验动物载药纳米粒和游离药物后，靶器官与各非靶器官的AUC之比，即 Te=AUC靶器官/AUC非靶器官。OA-NPs和OA-SOLs尾静脉注射后肝靶向的Te值见表7。

表7 OA-NPs和OA-SOLs小鼠尾静脉注射后的Te值Table 7 Te value after OA-NPs and OA-SOLs mice intravenous injection

结果表明，OA-NPs具有很好的肝脏靶向作用。

3 讨论

(1)本实验制备的OA-NPs属于主动靶向制剂，不但可通过控制纳米粒的粒径大小，实现齐墩果酸对肝脏的被动靶向作用，同时由于TPGS具有肝细胞特异性识别的作用，可使纳米粒又具有对肝脏的主动靶向作用，不但可增强齐墩果酸在靶位的活性、作用时间，还可减少给药量以及在非靶部位的聚集和毒副作用，使齐墩果酸能更好的发挥其作用。

(2)本实验制备的OA-NPs使OA在肝脏和血清中维持时间明显延长，在肝脏中的浓集作用明显加强，这是OA-NPs的缓释效应和肝靶向性所致。由图8和9可见，在血清中OA-NPs组的OA可维持到240 min，而OA-SOLs组仅能维持到60 min；在肝脏中OA-NPs组可维持到480 min，而OA-SOLs组也只能维持到120 min。

(3)本研究选用 4个靶向性评价指标评价OA-NPs对主要器官的靶向性，即TI、SI、Te和Re。TI和SI全面反映了各时间OA-NPs对主要器官的靶向性，但并未代表OA-NPs在整个观察时间段内对肝脏的靶性，即没有反映药物在体内作用的全过程。Te和Re以AUC作为比较单位，可以反映药物在整个观察时间段内的靶向性，能充分反映药物在体内的吸收、分布、消除等全过程。以上指标综合考察，全面客观地反映了OA-NPs对肝脏的靶向性。

(4)不少药物体内靶向分布研究采用同位素测定技术，原因在于该技术灵敏度高，生物样品处理简单，测定速度快，可进行大批量同时测定等优点。但也存在测定结果重现性差、代谢物干扰、放射性污染及同位素效应等问题。本试验采用 RP-HPLC法测定，建立的方法样品前处理简单，在所选条件下，内源性物质与OA能得到很好的分离，测定结果准确，重现性好，同时避免了由于放射性同位素的引入所导致的与原药不同的体内分布。