加速垃圾脱水组合菌的筛选及接种堆酵初步研究

商 平，李芳然

(天津市海洋资源与化学重点实验室，天津科技大学海洋科学与工程学院，天津 300457)

垃圾焚烧技术可以有效实现垃圾无害化、稳定化、资源化处置技术，凭借其特有优势性近年来备受关注[1]．而由于我国城市生活垃圾含水量普遍较高(40%～60%)[2]，焚烧厂广泛采用的传统垃圾堆酵技术能够在一定程度上实现新鲜垃圾水分脱除，但焚烧过程仍需要混合添加大量助燃剂提高垃圾整体低位热值，导致该工艺处理成本相对较高[3]．

传统堆酵技术脱水主要通过以下过程实现[4]：堆酵初期(1～2,d)通过重力挤压作用脱除大部分外部水分，后经微生物对有机成分降解作用沥出部分结合水及其他液态物质．从该技术原理出发，选择在第二阶段即微生物降解阶段接种外源微生物方法，从加速垃圾生物降解速率的角度提升其脱水效果具有一定的理论依据．

微生物接种技术是垃圾生物处理技术中常用方法，具有特定效用或适应特定环境的人工筛选合成微生物菌剂的加入能够缩短垃圾堆酵反应进程[5]．相关研究表明，采用接种微生物的方法可显著增加垃圾堆体微生物数量，提高纤维素酶活性[6–7]．而就微生物接种技术加快堆酵脱水反应速率方面国内外研究甚少．本文从不同菌源筛选出不同种类及功能的菌种(高温纤维素分解霉菌与细菌、除臭菌、软腐菌)，进行一定组合后接种于垃圾堆体中，探讨垃圾脱水量变化情况．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 堆酵原料

原料取自天津科技大学食堂及水果店，分类后粉碎至5,mm粒径，按照生活垃圾组成成分配制为模拟垃圾，组成成分为果蔬60%、厨余 15%、渣土10%、纸张10%、麦麸5%．添加锯末调节碳氮比至25[8]，含水量为70%左右．

1.1.2 菌源

矿化腐熟垃圾，取自大连某垃圾填埋场；风干牛粪堆肥；大白菜软腐组织．

1.1.3 培养基

察氏培养基(g/L)：蔗糖 30，硝酸钾 3，氯化钾0.5，磷酸氢二钾1，硫酸亚铁0.01，硫酸镁0.5．

LB培养基(g/L)：蛋白胨 10，酵母浸出汁 5，氯化钠10．

牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏 5．

刚果红(CMC)培养基(g/L)：磷酸氢二钾1，羧甲基纤维素钠 10，硝酸钠 2.5，硫酸镁 0.3，氯化钙 0.1，氯化钠0.1，氯化亚铁0.01．

以上培养基中以 20,g/L的量加入琼脂粉即制备成为固体培养基．

灭菌麦麸：霉菌扩培，含水量60%．

1.2 方法

1.2.1 菌体筛选

(1) 高温纤维素分解菌(霉菌、细菌)筛选

初筛：取 10,g矿化腐熟垃圾样品加入至 90,mL生理盐水中，振荡20,min后静置，制备 10-6稀释液；取稀释液分别涂布接种于察氏培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中，55,℃恒温培养24,h．

复筛：分别取两种培养基长势良好的菌落1环接种于 5,mL的 LB液体培养基中，35,℃、130,r/min恒温摇床振荡培养1,d即成种子液．无菌条件下分别吸取 1,mL种子液于 100,mL的 LB液体培养基中，35℃、130,r/min恒温摇床振荡培养 1,d即成扩培液．分别吸取1,mL扩培液于刚果红培养基上进行平板涂布培养，55,℃恒温培养 24,h，形成透明圈的菌株接种于斜面培养基，恒温 35,℃培养 24,h，4～6,℃保存．具有纤维素分解功能的霉菌与细菌各 1株分别标记为 M1、GX1．

(2) 除臭菌的筛选

初筛：取 10,g风干牛粪堆肥样品同上于牛肉膏蛋白胨固体培养基进行涂布分离并划线分离纯化 3次，得到4组纯化平板，从中分别挑选1个优势单菌落接种于斜面培养基，恒温 28,℃培养 24,h，4～6,℃保存．

复筛：将分离得到的 4种菌株分别接种于装有100,mL垃圾渗滤液(取自泰达环保)的 250,mL三角瓶中，用保鲜膜封口，30,℃恒温培养，间隔 24,h用感官法初步判断除臭效果并进行记录，选择除臭效果最好的1株菌标记为CX1．

(3) 软腐菌的筛选

取大白菜软腐组织于 70%酒精中浸泡 2～3,s[9]，用去离子水冲洗，将浸泡组织转移至 0.5,mL生理盐水中捣碎，静置 15,min，制备菌悬液．稀释菌悬液于LA培养基上进行平板划线分离，恒温 28,℃培养24,h后挑取2个长势良好、菌落形态明显的单菌落进一步转接纯化，获得4组纯化平板，从其中挑选1株优势单菌落将其标记为RX1．

1.2.2 堆酵实验

(1) 堆酵设备

堆酵反应在自行设计的底部锥形的柱状 PET材质容器中进行，设备简图如图 1所示．设备分为堆酵反应区、压重、出水收集三部分，反应区下部为倒锥形以保证出水效果，柱形区高度为 20,cm，直径为6,cm，锥形区高度为 5,cm，由于堆酵材料量较少且需排除蒸发失水的测定误差，为模拟堆酵过程条件，反应区进行密封，底部出水面设置孔径为 1,mm 的纱网．压重的作用为模拟堆酵过程中重力挤压脱水作用，弥补堆酵材料质量较小的不足，压重质量为300,g．

(2) 堆酵方法

实验过程中，因反应器未设计保温系统，由于堆酵物料质量较小(400,g)，在模拟真实堆酵进程中高温内部环境有一定困难，反应器置于 30,℃恒温培养箱中以确保所分离微生物均能较好地生长．将筛选出的各菌株进行种子液培养后制备扩培液，霉菌则在含水率为60%的麦麸培养基进行扩培，以10%接种量接种至收集的模拟高含水量垃圾中．由前期初步堆酵可行性实验得知，烧杯中析出液体为均质、密度相同或相近，以析出液体质量与初始堆酵材料质量比值即减重比率作为表征脱水效果的指标．

图1 设备示意图Fig.1 The equipment diagram

1.2.3 脱臭实验

将待试菌株按照一定比例接种于模拟垃圾(约300,g)，模拟垃圾置于以保鲜膜密封的大烧杯中，充分搅拌、混匀，以加入等量的自来水实验组为空白对照组，将各实验组恒温 30,℃堆酵处理，采用六阶段臭气强度法[10]每隔 24,h评价各堆酵组产生的臭气强度．

2 结果与分析

2.1 堆酵结果分析

2.1.1 筛选菌株共存性分析

向反应器中分别以 10%接种量接种 CX1、GX1、RX1、M1单菌种及任意两种菌株 1∶1组合菌(CX1＋GX1、CX1＋RX1、CX1＋M1、GX1＋RX1、GX1＋M1、M1＋RX1)，以加入等量自来水实验组为空白对照组进行 98,h堆酵反应，以脱水量所占堆酵原料的比例，即减重比率为指标绘制曲线，结果如图 2所示．

由图2可以看出：各实验组累积出水量变化趋势大致相同，0～40,h各组脱水量增长速率较大，可能是因为在此阶段垃圾自由水含量较高，较易通过重力挤压及微生物分解作用实现较好脱水效果；各组间总脱水量差别明显，霉菌第 98,h累积脱水率(总减重比率)达到48.84%，脱水效果最佳，菌株GX1的累积脱水率为 45.69%，仅次于菌株 M1，菌株 CX1第 98,h后累积脱水率为38.36%，与菌株GX1相比脱水率较低，而接种菌株 RX1单菌实验组该指标值仅为33.98%；菌株 M1、GX1各复合菌减重比率均低于单菌发酵减重比率，并且减重比率值大小同单菌脱水效率有关；菌株CX1、RX1与其他菌种复合后脱水效率显著提高；空白对照组 98,h后减重比率仅为30.92%，远低于以上各组单菌及复合菌这一比率值，可确定各菌株两两间可以共存．

图2 接种不同菌株对脱水效果的影响Fig.2 Effect of inoculating different microorganismson dehydration

2.1.2 菌种复合比例

(1) 比例初步确定

以菌株M1为两两组合菌的固定菌种，按照表1设定各菌种的组合比例，根据各测定阶段累积出水量计算出各组垃圾减重比率作为分析指标，得到不同配比各组复合菌剂的堆酵脱水情况，如图 3—图 5所示．

表1 菌株M1与各实验菌种复合比例Tab.1 Mixing proportions of M1 with other strains

图3 菌株M1、GX1接种比例对脱水效果的影响Fig.3 Dehydration curve of different M1/GX1 ratio

图4 菌株M1、RX1接种比例对脱水效果的影响Fig.4 Dehydration curve of different M1/RX1 ratio

图5 菌株M1、CX1接种比例对脱水效果的影响Fig.5 Dehydration curve of different M1/CX1 ratio

由图 3—图 5可以看出：菌株 M1与 GX1最佳复合比例为 1∶1，以该比例接种，培养 80,h时累积减重比率可达32.76%；菌株M1与CX1最佳复合比例为 2∶1，以该比例接种，培养 80,h时累积减重比率可达 37.17%；菌株 M1与 RX1最佳复合比例为1∶1，以该比例接种，培养80,h时累积减重比率可达37.67%．综上分析可初步确定菌株 M1、GX1、RX1、CX1组合比例为2∶2∶2∶1．

(2) 多菌组合接种优势性分析

以初步确定的最佳接种比例2∶2∶2∶1同时接种菌株 M1、GX1、RX1、CX1，与以上确定的双菌优势组合及单菌优势菌进行接种脱水效果对比，以确定4菌株组合接种的脱水优势性．各堆酵组脱水效果见图 6．

由图 6可知：菌株 M1、GX1、RX1、CX1复合实验组前 24,h优势性并不明显，可能是因为各菌在发酵系统中首次组合需要一定的适应稳定期，24,h后组合优势性逐渐明显，脱水速率迅速升高，72,h时累积减重比率最高，可达到 52.42%；菌株 M1、RX1复合实验组仅次之，累积减重比率为 50.07%．由此可知，菌株 M1、GX1、RX1、CX1复合菌在加速模拟垃圾堆酵脱水方面具有优势性．

各菌在堆酵过程中协同作用，共同加速堆酵进程．生活垃圾中水分含量较高的组分为果蔬等有机垃圾，这些有机组分纤维素分解能够使得细胞壁组织快速降解、加速堆体的腐化及结合水释放．通过接种纤维素分解菌，可显著提高高纤维物质的降解率[11]、加快堆肥升温[12]．从腐熟矿化垃圾中筛选出的高温纤维素分解功能的霉菌与细菌既具有特定分解功能，同时还长期适应垃圾堆酵环境，能够缩短接种后适应调整期；从风干牛粪堆肥中筛选得到的除臭菌的复合加入在加速堆酵脱水方面是明显增进的；软腐菌作为一种致病性细菌，能够起到使果蔬快速腐烂的作用，该部分接种实验软腐菌的加入虽效果不太明显，但对于复合菌种整体而言，其具有正面的促进作用．

图6 多菌组合接种与优势组脱水效果对比Fig.6 Contract of dehydration results between the inoculated combined strains and the dominant groups

(3) 复合比例的优化

4株菌复合接种，在初步确定的菌株 M1、GX1、RX1、CX1组合比例为 2∶2∶2∶1上下取值进行 4因素3水平正交实验，实验结果见表2．

表2 正交实验结果Tab.2 Results of the orthogonal experiments

由正交实验结果可分析得出，菌株最佳复合配比为菌株 M1∶GX1∶RX1∶CX1＝2.5∶2.5∶2.5：1．按照此比例进行证实性接种堆酵实验，72,h时脱水比率可达60%．

2.1.3 复合菌接种量对脱水效果的影响

增大接种量能够使得引入菌群更快适应堆酵环境从而缩短调整期，加快堆酵反应进程．接种量的多少直接关系到垃圾生物处理实际应用的投入成本，该部分实验目的是在实现垃圾堆酵脱水量较大的同时尽可能较大程度上减少复合菌剂接种量．以 4%为最大选择接种量，结果如图7所示．

图7 不同接种量对脱水效果的影响Fig.7 Dehydration results of different inoculation amount

由图 7可知，接种量为 4%时堆酵系统脱水效果最好，72,h时累积减重比率为 74.25%，接种量为 2%时次之，累积减重比率为 69.31%，接种量为 0.4%时，前 56,h接种优势性不明显，小于接种量为 1%、0.8%实验组，而随着堆酵反应进行，56,h开始该实验组脱水量以较大速率增加，72,h时其累积减重比率可达61.36%，高于接种量 1%、0.8%实验组．可能是由于当接种量足够大(4%、2%)时，引入微生物的优势性比较显著，大量的外来微生物能够显著抑制土著微生物生长代谢作用，成为堆酵反应系统的主导菌种，而当接种量减小(1%、0.8%、0.6%)时，外来引入微生物在堆酵前期仍存在优势性，但由于其数量限制不足以抑制土著微生物的生长繁殖，在堆酵后期，土著微生物适应调整期后数量增加，引入菌种与土著微生物之间相互抑制，从而导致堆酵后期脱水速率较低，而当接种量为 0.4%时，接种微生物能够在堆酵前期发挥主导微生物作用，堆酵后期与土著微生物相互抑制作用减弱，从而使得土著微生物在堆酵后期能够发挥降解优势，这一推测可通过空白组脱水率变化印证．

以 0.4%接种量，按照最佳接种条件进行验证实验，各组 72,h时累积减重比率分别为 62.35%、61.94%、65.78%．

2.2 组合菌除臭效果分析

分别按照 0.4%的接种量向模拟垃圾中以 M1∶GX1∶RX1∶CX1＝2.5∶2.5∶2.5∶1的比例接种组合菌及菌株 CX1，与空白对照组堆酵产生的臭气强度对比，结果见表3．

表3 接种堆酵除臭效果分析Tab.3 Deodorizing result of the inoculated experimental strains

由表 3可以得出，组合菌与除臭菌 CX1的接种均能够较为显著降低堆酵垃圾的臭度，发挥较好的脱臭效果．小试实验并不能模拟真实产生大量 H2S、NH3的实际堆酵过程，组合菌的脱臭效果需在中试实验中进行观察或量化探讨．

3 结 论

从矿化垃圾中筛选出了具有纤维素分解功能的高温霉菌与高温细菌各1株，从风干腐熟牛粪中筛选出1株具有除臭效果的细菌，从大白菜软腐组织中筛选出 1株软腐菌．各菌种两两共存，且都具有较高的有机物降解能力，接种量为 10%时，接种霉菌与高温菌脱水量可分别提高堆酵脱水量至空白组的 25倍、20倍．

多菌种复合接种堆酵具有可行性，堆酵脱水结果较单菌接种及两两接种有明显提升，确定了M1∶GX1∶RX1∶CX1的最佳组合比例为 2.5∶2.5∶2.5∶1．

以 0.4%接种量进行接种，既能够达到较高的堆酵脱水率(61.36%)，又能保证今后菌种扩大应用成本不致过高，且具有一定的脱臭效果，为复合菌种的实用性提供了理论基础．

本文以模拟垃圾为堆酵原料，初步确定了筛选所得微生物菌种的最佳接种条件，为在真实生活垃圾的接种堆酵脱水应用提供了可行性依据．

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