在线固相萃取-高效液相色谱检测功能饮料中VB12

陈淑芬，郭丽萍，金燕

1(兰州石化职业技术学院 石油化学工程系，甘肃，兰州，730060)2(赛默飞世尔科技中国有限公司应用研究中心北京实验室，北京，100080)

VB12又称钴胺素，是一种水溶性维生素［1］。VB12以辅酶形式参与代谢过程，促进DNA和蛋白质的合成，促进细胞的成熟，维持神经组织的正常功能，缺乏VB12时会产生恶性贫血、神经系统的损害［2］。VB12的主要来源是动物性食物，如动物肝脏、牛肉、猪肉、蛋、牛奶、乳酪，而VB12的含量非常微量，添加维生素的饮料中含量仅为0.2～20 μg/L。含量过低，是用高效液相色谱法测定饮料中VB12含量的难题［1］。

目前，文献报道的VB12测定方法主要有微生物法［3］、荧光法、高效液相色谱法［4］、凝胶色谱-高效液相色谱法等。而微生物法操作繁琐，时间较长;荧光法稳定性不够好;现有的高效液相色谱法仅适用于测定含量高的预混料;凝胶色谱-高效液相色谱法使用的凝胶净化柱特异性较强，但价格昂贵［1］。国家标准GB/T 5009.217－2008保健食品中VB12的测定虽列于适用于功能性饮料检测，方法检出限为3 μg/L，但采用的是免疫亲和柱，成本高，且对于饮料中添加量低于1.0 μg/L的样品按取样25 mL进行检测，检出限仍达不到要求。也有文献报道使用离线固相萃取-高效液相色谱法对微量VB12进行离线除杂及浓缩后再进行检测［1，5］。

本文利用双泵技术、阀切换技术和在线固相萃取技术，通过在线固相萃取柱的特殊选择性保留VB12和部分干扰物，在线将绝大多数干扰物质排出，然后通过阀切换使用另一个泵将VB12反冲到分析柱上进行检测。方法操作方便、灵敏度高、耗时短、重现性强，对VB12的检出限可以达到 0.54 μg/L，回收率达101.29%。该方法具有很好的可操作性，可以用于功能饮料等复杂液体样品中VB12的检测。

1 材料与方法

1.1 样品

市售功能性饮料。

1.2 主要试剂

VB12(J＆K，对照品，纯度 98%);乙腈(Thermofisher，HPLC 级);三氟乙酸(Dikma，HPLC 级，纯度99.5%);实验用水均为电阻率为18.2 MΩ cm的去离子水。

1.3 仪器及设备

Ultimate 3000双梯度高效液相色谱(Thermofisher，美国)，包括双泵(DGP)模块、自动进样器(AS)模块、柱温箱(TCC)模块;双泵模块中包含2个独立的三通道梯度泵，可分别用于梯度洗脱进行样品分析;柱温箱模块中放置在线固相萃取柱和分析柱，温度设为30℃，并置一个二位十通阀，可用于流动相和柱子之间的切换;检测器是二极管阵列检测器(Thermofisher Ultimate 3000);Chromeleon 7.1色谱工作站(Thermofisher，美国);超纯水设备(Barnstead，Thermofisher，USA)。

1.4 溶液的制备

1.4.1 标准品溶液和样品溶液的配制

精确称取42 mg的VB12标准物质，使用超纯水溶解并定容至25 mL，制成1 680 mg/L浓度的VB12标准品溶液，并依次稀释成 1.05、3.15、5.04、10.08 及20.16 μg/L 浓度的 VB12标准品溶液，分别经 0.45 μm的滤膜过滤后装瓶，待测。

将功能饮料经过2层0.45 μm的滤膜过滤后装瓶，待测。

1.4.2 色谱条件

在线固相萃取色谱柱:Thermofisher IonPac NG1柱(4 mm ×35 mm)。

分析色谱柱:Thermofisher Acclaim PAII C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)。

采用梯度淋洗，在线固相萃取色谱柱条件见表1，分析色谱柱条件见表2，阀切换时间见表3，仪器连接见图1。检测波长为220 nm。柱温30℃。进样体积为 1 000 μL。

图1 仪器连接图Fig.1 Graph of HPLC connection

表1 测定功能饮料中VB12在线固相萃取柱的梯度淋洗程序Table 1 Gradient conditions of SPE column for determination of Vitamin B12in Functional Drink

表2 测定功能饮料中VB12分析柱的梯度淋洗程序Table 2 Gradient conditions of analysis column for determination of Vitamin B12in Functional Drink

表3 测定功能饮料中VB12的阀切换程序Table 5 Valve switching conditions for determination of Vitamin B12in Functional Drink

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

在200～600 nm对VB12标准品的光谱吸收进行扫描，结果显示，λ=220 nm时，VB12有较大吸收，所以选择220 nm为检测波长。

2.1.2 色谱柱的选择

由于VB12在反相色谱柱上保留能力很强，所以选用C18机制的Thermofisher Acclaim PAII色谱柱作为分析柱，选用乙腈及0.025%三氟乙酸水溶液作为洗脱液进行梯度洗脱。

由于VB12在功能饮料中的含量一般在10 μg/L左右，浓度比较低，如果直接进行高效液相色谱分析，需要增大进样体积才能检测到该浓度的VB12，可能会超出色谱柱的承受范围，导致色谱柱寿命减短，而且由于饮料中大量的干扰物质存在，很难对该浓度下的VB12进行准确的检测。如果对功能饮料样品中的VB12进行离线反相固相萃取处理后，会很大程度上富集样品并降低干扰，但是处理起来比较繁琐，耗时。

本方法在固相萃取原理的基础上，采用Thermofisher双梯度液相色谱仪器特有的双泵技术和在线阀切换技术对样品进行在线固相萃取后进入分析柱进行分析，过程中避免了手动操作的误差及节省了离线处理的步骤，操作简单(在线固相萃取结果见图2)。

图2 在线固相萃取后功能饮料与标准品对比图(1为10 μg/L VB12标准品结果，2为功能饮料检测结果)Fig.2 Chromatography overlaid of Functional Drink with standard addition and standard with online SPE HPLC

2.2 方法学验证

2.2.1 线性、线性范围及重现性

按照在线固相萃取方法优化后的液相色谱条件，进样体积可以增大到1 000 μL，对VB12标准品分析，所得检出限(S/N=3)、线性范围数据列于表4。该方法用于VB12的检测，灵敏度高，VB12的检出限在0.54 μg/L(1 000 μL进样);线性范围较宽(1.05～20.16 μg/L)。由于每次分离结束后增加了一定时间的色谱柱平衡程序，大大提高了测定结果的重现性，VB12(浓度为10.08 μg/L)连续5次进样时保留时间的RSD＜0.01%，连续5次进样峰面积的RSD＜0.9%，具体数据列于表5。

2.2.2 回收率考察

在功能饮料样品中加标制成加标10 μg/L VB12的功能饮料样品，按照改进后的在线固相萃取色谱方法进行检测，得到回收率可达101.29%，说明在线固相萃取过程中，基本上没有造成VB12的损失，此在线固相萃取方法可以用于实际饮料中VB12的检测。

2.3 样品测定

精确量取样品适量，按1.4.1条件处理样品后，再按照1.4.2色谱条件测定样品中VB12含量。结果显示，功能饮料中含有5.6 μg/L的VB12，在功能饮料的标识含量范围内。

表4 VB12的检出限及线性范围Table 4 Detection limits and linearity of Vitamin B12

表5 10.08 μg/LVB12的重现性数据Table 5 Repeatability data of 10.08 μg/L VB12

3 讨论

本文根据Thermofisher IonPac NG1色谱柱对于VB12和干扰物的选择性不同，选择Thermofisher IonPac NG1色谱柱作为在线固相萃取柱，将VB12和少量干扰物保留在在线固相萃取柱中，大部分干扰物被排除，然后通过另一个泵将被保留的VB12和少量干扰物反冲到分析柱中进行分析，很大程度上降低了干扰，增加了灵敏度，检出限达到0.54 μg/L。本文使用双泵和阀切换技术将在线固相萃取技术应用于功能饮料中的VB12的检测，VB12的回收率达101.29%。该方法具有很好的可操作性，可以用于功能饮料等复杂液体样品中VB12的检测。

［1］ 周芳梅，蔡双福，文灿，等.固相萃取-高效液相色谱法测定饮料中维生素B(12)［J］.现代食品科技，2010，26(7):759－762.

［2］ 罗祎，郝常明.VB12的研究及其进展［J］.中国食品添加剂，2002(3):15－19.

［3］ GB 5413.14－2010.食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定［S］.

［4］ GB/T 17819－1999.维生素预混料中维生素B12的测定高效液相色谱法［S］.

［5］ 李红艳，王瑾，邵亮亮，等.固相萃取-高效液相色谱法测定功能性饮料中微量维生素B-12［J］.浙江农业科学，2012(3):384－386.