高效抑氨芽孢菌的筛选

刘乃芝，陈 静，徐 辉，闫福海，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000）

随着我国畜牧业生产规模化、集约化程度的不断发展，畜禽产生的大量粪尿和有毒有害气体（例如NH3、H2S、CH4、吲哚、粪臭素等）对环境的污染不断加剧[1-3]。不仅对人类的健康造成极大的威胁，而且严重影响着畜禽健康和生产性能的发挥[4-8]。随着公众环境意识的进一步增强，畜禽业对于环境的污染也面临着很大的压力；对畜禽粪污的处理国内外已研究出许多方法，除了通过合理的营养配方、科学的畜牧场规划设计和饲养管理以外，近年来发展起来的微生物处理方法更是研究热点。微生物除臭即利用微生物进行除臭，因具有除臭效率高、无二次污染、所需设备简单等优点，成为当前研究的主要方向[9-14]。研究发现，NH3挥发量与粪便中其他致臭物质挥发高度相关（R=0.94），减少NH3挥发，可减少粪便恶臭[15]。氨气浓度的高低常作为衡量养殖场环境空气好坏的重要指标之一[16]。因此，筛选高效的氨同化微生物，进行生物脱臭，是控制养殖场恶臭的一个重要研究方向。本研究是在前人研究的基础上，对本研究室前期土壤和污水中分离的百余株芽孢菌进行氨氮降解菌的筛选，以期获得降氨、除臭效果最佳的芽孢杆菌，并对其效果进行验证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种：由宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院提供芽孢杆菌127株。

芽孢杆菌培养基：葡萄糖0.2%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，酵母膏0.5%，pH 7.0。

紫色石蕊的配制：在250mL的烧杯中注入蒸馏水150mL，加入半药匙石蕊粉末，微热至50～60℃，搅动加速溶解形成深蓝紫色溶液，即原液，备用。不断搅拌的条件下，在蓝紫色石蕊原液中逐滴加入极稀的磷酸溶液，直到溶液变紫为止。若磷酸溶液稍过量，则会调成红色石蕊。

BTB溶液：1%溴百里酚蓝的酒精溶液。

氮素-限制性培养基：葡萄糖2.5 g，NH4Cl 0.125 g，NaCl 0.25 g，MgSO4· 7H2O 0.25 g，Mn-Cl2· 4H2O 0.05 g，K2HPO40.5 g，KH2PO41.6 g，1%ZnSO42mL，CoCl20.002 g，用0.45μm滤膜除菌，pH 7.0～7.2。

抑氨菌富集培养液:（NH4）2SO42.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，CaCO35.0 g，FeSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 2.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.2， 1×105Pa灭菌20min[15]。

1.2 试验方法

1.2.1 降氨菌的初筛

将芽孢菌127株分别接种到含50mL无菌芽孢杆菌液体培养基中，37℃、180 rpm摇床培养24 h制备成种子液，在无菌超净台内用灭菌枪头吸取少量种子液，点在含有紫色石蕊的氮素-限制性平板培养基上，37℃条件下培养24 h后，在此平板培养基上均匀地覆盖上BTB溶液，观察菌落及其周围的染色环，并测定其直径大小。根据式（1）评定微生物利用氨的强弱。

其中D为菌环的平均直径（cm），d为菌落的平均直径（cm）。平均直径（cm）＝（纵向直径＋横向直径）/2，直径测量值精确到0.01 cm[14]。

1.2.2 降氨菌的复筛

抑氨菌的筛选：将种子液按2%的接种量接入装有100mL抑氨菌富集培养基的三角瓶中（同时设两个对照，分别为加入等量的培养基和无菌水），每组两个重复，37℃，180 rpm摇床培养15 d，每隔3 d检测1次培养基中的氨氮含量，检测前在无菌超净台中取样，5 000 rpm离心10min，上清液采用纳氏比色法进行氨氮含量的检测。

1.2.3 对粪便中氨氮的降低效果试验

将复筛过程中氨氮去除率＞20%的菌株进行粪便中氨氮的降低效果试验。将各菌株以2%接种量（对照组为等量无菌水）添加入装有100 g新鲜鸡粪的三角瓶中，每菌株2个平行，搅拌均匀，并在三角瓶中吊入装有20mL 2%硼酸吸收液的50mL三角瓶，放置于室温并密封，每隔24 h取出各组盛有硼酸吸收液的三角瓶，以0.010 68mol·L-1硫酸溶液进行滴定，指示剂为溴甲酚绿-甲基红指示液，滴定过程中以溶液颜色由蓝绿色变成灰紫色为终点。各组取出硼酸吸收液后敞口1 h，之后再放入等量硼酸并重新密封，共测定4 d，计算氨氮浓度及氨氮去除率，其计算式见式2～3[15]。

式中c为滴定用硫酸溶液的物质的量浓度，mg·L-1；v为滴定各组硼酸吸收液消耗硫酸溶液体积的平均值，mL；14为氮的质量分数，g·mol-1；V为2%硼酸吸收液体积，mL。

式中，c为滴定用硫酸溶液物质的量浓度，mol·L-1；v0为滴定对照组消耗硫酸溶液体积的平均值，mL；v为滴定菌株纯培养液消耗硫酸溶液体积的平均值，mL；14为氮的质量分数，g·mol-1；V为硼酸吸收液体积，mL。

1.3 统计分析

试验数据采用Excel进行统计分析，结果以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 降氨菌的筛选

菌种资源中心提供的127株芽孢菌，经过初步筛选之后，有89株芽孢杆菌菌落周围形成黄色晕环。其原因为芽孢杆菌接种到氮素限制性鉴别平板培养基上之后，随着芽孢杆菌对氨同化的进行，培养基中的含氮成分逐渐减少，并被消耗掉，菌落周围的pH逐步降低，进而使培养基与添加的溴百里酚蓝指示剂发生显色反应，在菌落周围形成黄色环。由于菌落形态不规则，因此菌落周围的晕环无法精确测量，通过大批量试验结果总结发现，只要菌株能在此培养基上生长，就可在菌落周围见黄色晕环，即该菌株可以利用培养基中的氨氮。通过对89株芽孢杆菌在抑氨富集培养基中的复筛，得到与对照组相比氨氮清除率＞20%的有6株，氨氮清除率＞20%的菌株见表1。

表1 氨氮清除率＞20%的菌株

2.2 对粪便中氨氮的降低效果试验

将前期筛选出的氨氮降解率＞20%的6株芽孢杆菌进行粪便中氨氮降低验证效果试验。各组的氨氮浓度见表2。

表2 各组不同时段的氨氮浓度mg·L-1

从表2中可以看出，随着时间的延长，各组的氨氮浓度均逐渐增加并趋于稳定。本试验中选择每24 h打开各组盖子敞口1 h，目的是为了增加容器内的空气流通，保证芽孢杆菌及粪便中其他需氧菌的正常生长活动，在准确收集各组产生氨氮的基础上，尽量模拟养殖场的自然环境。

各组不同时段的氨氮去除率见附图。

附图 各组不同时段的氨氮去除率

从附图中可以看出，随着时间的延长，各组的氨氮去除率基本呈现逐渐降低的趋势，24 h各组的氨氮去除率相对较高，其中Y-64组的氨氮去除率为33.33%，Y-85组为22.22%。

3 讨论

早在20世纪四五十年代，欧洲等发达国家就进行了除臭方法的研究，除臭微生物的筛选工作也于那时开始起步，近几年也有研究者分离到了效果更好的菌，KIM等分离到一株能将NH3浓度降低98.5%的乳酸杆菌[9]。我国对除臭微生物的研究起步较晚，昌艳萍等从新鲜鸡粪中分离得到菌株J-3和J-6可将NH3浓度分别降低70.46%和35.05%[12]。陈丽园等分离到的菌株10MG可使NH3浓度降低67.95%[13]。冯健等利用自行分离的3株菌和引进的4株菌，进行了除臭效果试验，发现混合菌对NH3的去除率在67.90%～83.55%[16]。本试验筛选出的Y-64对粪便中的氨氮降解率在24 h后达到33.33%，表明Y-64具有较好的降低氨氮的作用，可以考虑将其作为益生菌来利用。本试验中，尽管经复筛筛选出的6株芽孢菌均具有一定降低粪便中氨氮的能力，但同一菌株氨同化能力在复筛和对粪便中氨氮的降解效果试验两个阶段统计所得的数据不一致，呈现出一定的差异，推测可能是由于抑氨富集培养基中与粪便环境中营养成分和菌群间的差异所导致。本试验筛选出的芽孢菌具体生理性能及除臭机理有待进一步研究。

[1]Lacey R E,Mukhtar S,Carey JB,etal.A review of literature concerning odors,ammonia,and dust from broiler production facili-ties:1.Odor concentrations and emissions[J].JAppl Poult Res,2004,13（3）:500-508.

[2]PowersW J,Angel CR,Applegate T J.Air emissions in poultry production:current challenges and future directions[J].J Appl PoultRes,2005,14（3）:613-621.

[3]Siegford JM,PowersW,Grimes-casey H G.Environmental aspects of ethical animal production[J].Poult Sci,2008,87（2）:380-386.

[4]Frazer L.Agriculture:Green screen for poultry farms[J].Environ Health Perspect,2008,116（11）:477.

[5]Miles DM,Branton SL,Lott BD.Atmospheric ammonia isdetrimental to the performance ofmodern commercial broilers[J].Poult Sci,2004,83（10）:1 650-1 654.

[6]Fairchild B D,Czarikck M,Harper L A,et al.Ammonia concentrations downstream of broiler operations[J].J Appl Poult Res,2009,18（3）:630-639.

[7]Heederik D,Sigsgaard T,Thorne PS,etal.Health effects of airborne exposures from concentrated animal feeding operations[J].Environ Health Perspect,2007,115（2）:298-302.

[8]Donham K J,Wing S,Osterberg D,et al.Community health and socioeconomic issuessurrounding concentrated animal feedingoperations[J].Environ Health Perspect,2007,115（2）:317-320.

[9]Kim JD,Kang K H.Isolation of Lactobacillus sakei strain KJ-2008 and its removalof characteristicmalodorousgasesunder anaerobic culture conditions[J].Biosci Biotechnol Biochem,2004,68（12）:2 427-2 435.

[10]赵晨曦,兰时乐,禹逸君,等.鸡粪除臭微生物菌群的筛选和应用[J].湖南农业科学,2005（1）:68-70.

[11]陈书安,黄为一,赵兵.除臭微生物分离和筛选方法的改进与应用[J].生物技术通报,2006（5）:126-129.

[12]昌艳萍,李彦芹,陈娟,等.鸡粪除臭放线菌的筛选及组合拮抗试验[J].湖北农业科学,2007,46（1）:60-61.

[13]陈丽园,吴东,夏伦志,等.畜禽粪便除臭微生物的分离与筛选[J].畜牧与兽医,2008,40（12）:59-61.

[14]杨柳,张邑帆,郑华,等.高效除臭微生物的原位筛选与鉴定[J].上海畜牧兽医通讯,2012（2）:14-16.

[15]陈国营,詹凯,陈丽园,等.蛋鸡粪抑氨菌选育及其抑氨机制[J].中国微生态学杂志,2012,24（7）:582-587.

[16]冯健,方新,于淼.生物除臭剂在畜禽粪便除臭中的应用试验[J].现代农业科技,2009（20）:286-288.