尿素-SDS-PAGE测定小分子多肽相对分子质量方法的建立

王丽荣，程福亮，陈 雷，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000）

蛋白质的生化分析和基因表达产物的分离纯化中，难免会需要分离某种或某些小分子蛋白质成分。近年来，用电泳法测定小分子多肽分子量的研究报道较少。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）方法用作蛋白质相对分子质量测定的技术最早由Shapiro等于20世纪60年代建立，随后Weber等进行了改进，显示出了该方法在分离鉴定和纯化蛋白质方面的优越性。随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出，而小分子多肽相对分子质量的测定，目前多采用Tricine-SDS-PAGE系统，但系统中的Tricine价格昂贵，电泳时间较长，且由于小分子多肽相对分子质量小，易受电泳缓冲系统、凝胶浓度、电泳时间、染色和脱色等的影响，极易引起条带扩散、不易着色，使分辨率降低，因而直接影响多肽相对分子质量的测定[1-2]。现有多肽相对分子质量的3层胶电泳测定方法操作复杂。张晓楠等采用尿素SDS-PAGE法快速测定相对分子质量为2 500～17 000的多肽[3]。石继红等也分别对小分子肽类进行测定[4]。

转移因子（TF）属于淋巴因子，可特异或非特异性地调节机体免疫状态、增强其细胞免疫和骨髓造血功能，已在临床应用多年，在原发性免疫缺陷病或慢性病毒感染疾病中作为免疫治疗药物作用，目前已得到肯定，特别是对病毒性上呼吸道感染治疗取得良好效果[5]。主要成分为小分子多肽和核苷酸，为免疫调节剂。本研究根据小分子多肽条带分辨率高、操作简便、分析时间少、低成本等原则，改进低相对分子质量蛋白——转移因子的尿素-SDS-PAGE方法，并为小分子多肽相对分子质量的测定提供有效方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

垂直电泳仪及其配件、Power PAC200稳压稳流电源由Bio-Rad公司生产；GDS28000凝胶图像处理系统由英国UVP公司生产。低分子量蛋白Marker购自北京天恩泽基因科技有限公司；小分子多肽样品由山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院保存。

1.2 试剂及配制

30%丙烯酰胺：称取丙烯酰胺29 g和N,N'-亚甲双丙烯酰胺1 g溶于超纯水80mL中，定容至100 mL。0.45μm滤膜过滤后，测定pH。10%SDS：称取SDS 10 g溶于超纯水80mL中，定容至100 mL。1.5 mol·L-1Tris-CL：称取 Tris-Base 18.171 g溶于超纯水80mL中，用浓盐酸调整pH至8.8，定容至 100 mL。0.5 mol·L-1Tris-CL：称取Tris-Base 6.057 g溶于超纯水80mL中，用浓盐酸调整pH至6.8，定容至100mL。10%APS：称取过硫酸铵2.282 g溶于超纯水8 mL中，定容至10mL。Running Buffer：称取 Tris-Base 3.03 g， Glycine 18.8 g， SDS 5 g溶解，定容至1 000mL。1×SDS上样缓冲液： 0.05mol·L-1Tris-HCL，100mM β-巯基乙醇，2%（m/V）SDS，0.1%（m/V）溴酚蓝，10%（V/V）甘油。染色液：0.1%（m/V）考马斯亮蓝R-250，25%（V/V）甘油，10%（V/V）冰醋酸。脱色液：10%（V/V）醋酸，5%（V/V）乙醇量取醋酸100mL、乙醇50mL溶于超纯水800mL中，定容至1 000mL。

1.3 试验方法

1.3.1 试验准备及样品处理

用自来水清洗烧杯、电泳仪及其配件，蒸馏水冲洗干净，晾干备用，玻璃板先用自来水清洗，擦干，酒精棉球擦干，自然晾干备用。

1.3.2 配胶

15%分离胶和5%浓缩胶的配制方法见表1。

表1 尿素-SDS-PAGE法制胶配方

5%分离胶：在烧杯中依次加入超纯水2.3mL、30%丙烯酰胺5 mL、1.5 mol·L-1Tris-CL 2.5 mL、10%SDS 0.1 mL、10%APS 0.1 mL、TEMED 0.004 mL，加入TEMED混合均匀后，立即用吸管加入胶板中（倒胶时，以梳子齿端为参照，预留1 cm浓缩胶空间），胶上加满蒸馏水封闭，以防蒸发，分离胶室温约30min即可完全凝固。5%浓缩胶：烧杯中依次加入合适量的超纯水2.1mL、30%丙烯酰胺0.5 mL、0.5 mol·L-1Tris-CL 0.38 mL、10%SDS 0.03 mL、10%APS 0.03mL，先将分离胶上的超纯水倒掉，并用滤纸小心吸干残留水分，再将TEMED 0.003mL加入烧杯中，混合均匀立即用移液枪滴加到分离胶上，插入合适的梳子，积层胶约20min可完全凝固。

1.3.3 加样

小心拔掉梳子，组装好电泳仪。然后倒入1×Running Buffer。将蛋白Marker和处理好的样品按顺序加入胶孔，并做好记录。

1.3.4 跑胶

加样完毕即可跑胶，可固定电压进行跑胶。Bio-Rad电泳仪可固定在200V，君意电泳仪固定在150V，当染带刚刚跑出胶板时，跑胶完成。

1.3.5 卸胶

小心拆卸胶板，用分离器小心将两层玻璃板分离，切去积层胶。

1.3.6 染色

将分离胶放于染色盒中，倒入染色液20mL，放在摇床上慢慢摇动。染色20min即可。

1.3.7 脱色

将分离胶取出，放于脱色盒，倒入脱色液30 mL，放在摇床上慢慢摇动过夜，或随时观察，直至分离胶除有蛋白的地方为蓝色其余部分变为无色即可。

1.3.8 小分子多肽样品中蛋白迁移率的测定及其相对分子质量的计算

用倍率计读出照片上各样品色带中心与溴酚蓝前沿的距离，按标记变化比率换算出实际尺寸进行计算。电泳迁移率为Rf，即样品迁移距离与溴酚蓝迁移距离的比值。以标准组多肽的迁移率为横坐标，以其对应的相对分子质量对数为纵坐标绘制标准曲线。然后根据未知样品的迁移率在曲线上查出其对应的相对分子质量。

2 结果与分析

2.1 小分子多肽样品的尿素-SDS-PAGE结果

小分子多肽样品的尿素-SDS-PAGE结果见图1。

图1 小分子多肽的尿素-SDS-PAGE蛋白电泳结果

由图1可知，小分子蛋白样品中蛋白浓度较高，SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白相对分子质量＜14.4 kD，样品纯度较高，无其他蛋白杂带，阴性对照无特定条带。

2.2 不同稀释浓度小分子多肽样品的尿素-SDSPAGE结果

不同稀释浓度小分子多肽样品的尿素-SDSPAGE结果见图2。

图2 小分子多肽样品不同稀释浓度的尿素-SDS-PAGE结果

通过10倍稀释小分子多肽样品，进行尿素-SDS-PAGE电泳，图2显示获得了较好的结果，A1～A5小分子蛋白样品浓度逐渐降低，呈现较好的规律变化。

2.3 尿素-SDS-PAGE中蛋白条带迁移率及分子量标准曲线的绘制

尿素-SDS-PAGE中蛋白条带迁移率及相对分子质量标准曲线的绘制见表2。

表2 尿素-SDS-PAGE中蛋白条带迁移率的测定

由表2中的数据绘制完成可进行测定小分子蛋白相对分子质量的标准曲线，见图3，其中相关系数R2＞0.99，表明建立的标准曲线可以用来测定小分子多肽的相对分子质量。

图3 标准曲线

2.4 小分子多肽样品中蛋白迁移率的测定及其相对分子质量的计算

测定尿素-SDS-PAGE电泳中小分子多肽样品的迁移率为23.5，将此数值带入到相对分子质量测定标准曲线方程中，计算得到待测小分子多肽样品的相对分子质量为9.212 977 277 kD。

3 讨论

随着生物活性多肽物质的发现和多肽类药物的研制，小分子多肽电泳已成为生物活性物质纯化分析过程中经常使用的快速鉴定方法。凝胶电泳操作简单、分辨率高，广泛应用于蛋白质相对分子质量的测定。蛋白质相对分子质量的测定通常采用非连续的SDS-PAGE缓冲系统，缓冲液采用Tris-HCl；而多肽相对分子质量的测定采用Tris-Tricine缓冲液，可使小相对分子质量多肽在浓缩胶中有效地浓缩，从而提高分辨率。SDSPAGE的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺与丙烯酰胺比值的增加而减小，相对分子质量＜10 000的小分子肽，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDSPAGE也不能完全分离。本研究建立的双层胶尿素-SDS-PAGE测定小分子多肽相对分子质量的方法操作简便，将常规的3层胶改为2层胶（分离胶和浓缩胶），浓缩胶与分离胶采用同一缓冲体系，简化操作步骤，减少由于凝胶制备而引起的诸多影响电泳的因素；分辨率高，将3层胶改为2层胶后，分离胶的有效长度增加，可使单位凝胶长度下容纳的电泳条带数增加，从而使分辨率提高；成本低，替代了昂贵的Tris-Tricine缓冲系统，电极缓冲液可以重复利用；电泳时间短，由原来5～6 h缩短为2.5 h，达到了快速检测的目的。

本试验用含6mol·L-1尿素的SDS-PAGE方法，不需银染而直接用考马斯亮蓝R2250染色1.5～2 h，即可把标准品中的条带显示清楚，且简单方便，试验范围内多肽相对分子质量的对数与迁移率呈良好的线性关系，相关系数达到0.993 8。该方法的建立为小分子多肽分子量的估算提供了一种较好方法。

[1]邹毅,祝沛平,赵晓丽,等.用一种改进的电泳方法测定抗冻蛋白的分子量[J].生物技术,1999,9（4）:37-40.

[2]杨联萍,孔祥平,易学瑞.SDS-PAGE电泳对小分子多肽的分析[J].生物工程进展,1998,18（6）:48-50.

[3]张晓楠,张延凤,曹云新,等.尿素-SDS-PAGE快速测定多肽的相对分子质量[J].细胞与分子免疫学杂志,2001,17（1）:87-97.

[4]石继红,赵永同,王俊楼,等.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽[J].第四军医大学学报,2000,21（6）:761-763.

[5]冯来坤,黄超美,杨洪群,等.转移因子口服给药国内外研究进展[J].中国生化药物杂志,1999,20（5）:265-267.