糖尿病大鼠肝纤维化对血糖变化的影响及其机制

熊盛池 熊利 余登国

[摘要] 目的 研究糖尿病所致大鼠肝纤维化对血糖变化的影响及其机制。 方法 将大鼠随机分为正常组1、2、3，每组12只；模型组1、2、3，每组12只。除正常组外，其余各组用STZ（链脲佐菌素）诱导并建立糖尿病SD大鼠模型，将造模成功的DM大鼠随机抽样分成以下3个组：模型组1、2、3，对组1、2、3分别干预处理8周、12周、16周，放射免疫测定肝纤维化指标：透明质酸、IV型胶原，测定空腹、餐后2 h血糖；免疫组织化学法检测肝组织TGF-β1表达。 结果 模型组肝纤维化指标明显增高，以模型组3为主；模型组空腹和餐后血糖波动明显，肝脏TGF-β1表达显著增高，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.05）。并且以模型组3差异最显著（P<0.01）。 结论 糖尿病大鼠肝纤维化对血糖有显著影响，且随病变加重而明显，其影响可能与TGF-β1在肝组织的表达增多有关。

[关键词] 糖尿病；肝纤维化；空腹血糖；餐后2 h血糖；转化生长因子β1

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）05-34-03

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種以慢性的高血糖持续升高为主的慢性并发症，主要影响心、脑、肾、眼、足，等多部位、多器官受损，但是临床医生及患者却忽略了糖尿病引起的肝脏病变。临床工作中糖尿病导致的肝脏病变，引起肝纤维化、肝硬化并不少见[1]，使得患者血糖发生剧烈波动，空腹低血糖，餐后发生高血糖，被认为患者是脆性糖尿病。经过临床住院治疗，按脆性糖尿病进行管理[2]，可血糖总是控制不好，却忽略了糖尿病所致肝脏病变是罪魁祸首。本研究通过对2007年3月～2012年10月期间所做的动物实验和临床观察研究，进一步证实这一理论，以便提供对糖尿病所致肝纤维化患者更好的血糖控制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 6～8周龄体重160～180 g的健康雄性SD清洁级大鼠72只，购于重庆医科大学实验动物中心，许可证号SYXK（渝）2006007。

1.1.2 试剂 TGF-β1试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备 按参考文献[3]稍加修改建立模型。取SD大鼠36只禁食12 h后，按40 mg/kg左下腹腔注射STZ，制造DM模型。给予足够的饮水，72 h后大鼠尾尖取血测空腹血糖，血糖≥7.0 mmol/L确定为DM成模大鼠，血糖≥18.0 mmol/L给予诺和灵N2-3 U皮下注射，以防糖尿病酮症酸中毒死亡，共成模34只。将成模大鼠随机分成3组：模型组1：11支、模型组2：11支、模型组3：12支，另取36只正常大鼠作为对照组，腹腔注射等量无菌柠檬酸钠缓冲液，尾尖取血测空腹血糖，血糖在3.8～6.8 mmol/L。造模7 d后，正常组给予普通食物供给，模型组在正常食物基础上加用高脂食物（20%熟猪油和3%胆固醇）。大鼠喂养条件为室温18～20℃，相对湿度68%，12 h交替照明，大鼠自由饮水、进食，对组1、2、3分别喂养8、12、16周。

1.2.2 取材与固定 相应组大鼠在喂养8、12、16周后，每日取空腹及3餐后血糖记录，以进行比较，共3 d。后用2%戊巴比妥钠40 mg/kg注入腹腔进行麻醉，尾静脉取血，分离血清，检测血清学指标。取肝组织适量，固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片5 μm，用于免疫组织化学法检测。

1.2.3 观察指标 （1）一般状况观察；（2）肝纤维化指标检测；（3）各组大鼠空腹及餐后血糖的比较；（4）肝组织TGF-β1（转化生长因子β1）免疫组化染色（三步法）。

1.3 统计学处理

应用SPSS12.0统计分析软件处理，计量资料采用单因素方差分析，计量资料用（）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况表现

模型组大鼠活动减少，毛发表现为不光滑并且比较粗糙，进食已不如造模前，粪便变稀，有多尿、多饮，消瘦表现，精神倦怠。正常组大鼠活动状态佳，精神好，毛发光滑并且色泽好，进食及大小便均无异常。

2.2 各组大鼠肝纤维化指标的比较

各组大鼠肝纤维化指标：透明质酸（HA）、IV型胶原（IV-C）检测结果见表1。模型组HA、IV-C增高显著，正常组HA、IV-C数值正常；两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）；模型组3与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 各组大鼠血糖的比较

正常各组中每一组空腹及餐后血糖处于正常范围，而且波动较小，差异无统计学意义（P>0.05），见表2；模型组各组的空腹及餐后血糖均异常，空腹与餐后血糖波动大，差异具有统计学意义（P<0.05）；以模型组3波动最大，其差异有统计学意义（P<0.01）。随着造模时间的延长，血糖波动越大，差异具有统计学意义。

2.4 各组大鼠免疫组化TGF-β1表达

各组TGF-β1平均阳性面积及平均吸光度（A）值比较。模型组阳性面积和平均吸光度高于其他各组（P<0.05），模型组3与正常组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。见图1、表3。

3 讨论

世界卫生组织发布的《2012年度世界卫生统计报告》显示，仅在2008年，全球约有3600万人死于非传染疾病，约占当年死亡人口总数的63%。《报告》预计，到2030年，全球死于非传染疾病的人口将增至5500万人。糖尿病等非传染疾病愈发呈现上升趋势，中国成年糖尿病患者已逾9200万，已超过印度成为世界第一大糖尿病重灾区。糖尿病已经成为中国最重要的非传染性疾病[4]，严重威胁人类健康。糖尿病有很多并发症，而导致肝脏纤维化的病变也得到越来越多的重视[5-6]。实验发现TGF-β1在模型组中的表达明显高于正常组。提示TGF-β1与糖尿病肝脏病变密切相关[7]。糖尿病肝纤维化的最主要病理改变是肝脏细胞脂肪变性、胶原纤维增生，细胞外基质（ECM）沉积最终导致弥漫性或结节性肝纤维化[8]。TGF-β1是目前最重要的促肝纤维化的活化因子之一，它可调节细胞外基质受体的表达，刺激ECM的产生[9]，还通过抑制胶原酶和蛋白酶的产生，从而使ECM在肝脏大量沉积而导致肝纤维化，最终导致肝硬化的发生[10]。IV-C为构成基底膜的主要成份，含量增高可较灵敏反映出肝纤维化过程，是肝纤维化的早期标志之一。HA为基质成分之一，由间质细胞合成，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况，在本实验中以上两指标均明显升高，可见肝纤维化已经发生。

近年来，糖尿病引起肝纤维化的报告逐年增多[11]，但糖尿病相关肝纤维化又恶性循环似的引起糖尿病患者的血糖波动大[12]，不易控制，却没有引起足够的重视，临床中常见肝纤维化或者肝硬化患者空腹血糖正常甚至偏低，而餐后血糖却异常增高[13]，即使使用胰岛素也不易控制，反复调整胰岛素的用量，剂量稍微大点低血糖就会发生，乃至低血糖昏迷，甚至诱发心血管并发症，剂量小点，血糖又升高，糖尿病酮症酸中毒又会出现。可是临床上仅仅通过对肝功能的改善，也达到了对血糖的改善，血糖波动小了，血糖稳定了，并发症明显减少，因此在此提出重视糖尿病患者肝功能的保护，重视对糖尿病患者肝脏疾病的防治，减少并发症，延长寿命，是每一个医务工作者的神圣使命。

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（收稿日期：2013-01-15）