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金关片镇痛抗炎作用的实验研究

2013-04-29刘彦博吴启富等

风湿病与关节炎 2013年9期
关键词:镇痛抗炎小鼠

刘彦博 吴启富等

【摘 要】目的:观察金关片的镇痛抗炎作用。方法:采用大鼠辐射热刺激实验、小鼠热板法实验、小鼠醋酸扭体实验来观察金关片的镇痛作用,采用小鼠毛细血管通透性实验、小鼠白细胞游走实验、角叉菜胶致小鼠足肿胀实验、小鼠棉球肉芽肿实验、大鼠巴豆性气囊肿实验、大鼠胸膜炎实验观察金关片的抗炎作用,采用小鼠肾上腺质量和维生素C含量测定金关片对肾上腺皮脂功能的影响。结果:金关片高、低剂量组均能提高大鼠辐射热刺激痛阈值,提高小鼠热板法痛阈值,抑制醋酸致小鼠扭体反应,抑制小鼠腹腔毛细血管通透性增高,抑制小鼠白细胞游走,减轻角叉菜胶致小鼠足肿胀的程度,抑制小鼠棉球肉芽肿的形成,抑制大鼠巴豆性气囊肿的形成,减少大鼠胸膜腔中白细胞的数量。金关片组大鼠肾上腺内维生素C含量明显低于空白组(P < 0.05或P < 0.01)。结论:金关片具有良好的镇痛抗炎作用,且与增强肾上腺皮质功能有关。

【关键词】 金关片;镇痛;抗炎;大鼠;小鼠

金关片在临床主要用于治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎等疾病,效果显著。本实验从动物实验角度对金关片的镇痛抗炎作用进行药效学评价,为金关片的临床运用提供理论基础和实验依据。

1 实验资料

1.1 实验动物 健康昆明小鼠,SPF级,雄性,体质量20~22 g,合格证号SCXK(粤)2012-A046SD;

大鼠,SPF级,雄性,体质量180~200 g,合格证号SCXK(粤)2012-A051。由南方医科大学实验动物中心提供。

1.2 药品及试剂 金关片(药物组成:雷公藤、细辛、桂枝、秦艽、桑枝、黄芪、山药、茯苓、薏苡仁、制附子、淫羊藿、枸杞子、黄精、鹿角霜、川续断、牛膝、鸡血藤、丹参。雅安三九药业有限公司生产,生产批号Z20054153);醋酸泼尼松龙(上海医药集团有限公司生产,生产批号H31020771);布洛芬(上海雷允上药业有限公司生产,生产批号08020219);吲哚美辛肠溶片(江苏亚邦爱普森药业有限公司生产,生产批号H32021431);冰醋酸(广东东华化学厂有限公司生产,生产批号20071225);二甲苯(广东东华化学厂有限公司生产,生产批号20070623);伊文思兰(美国Amresco公司生产);角叉菜胶(美国Sigma公司生产)。

1.3 仪 器 HP8453紫外-可见分光光度计(美国惠普公司生产);VT-1300U超净工作台(苏净集团安泰公司生产);950FS动物血球分析仪(美国Drew scientific公司生产);YLS-7B足趾容积测量仪(山东省科学院药物研究所提供);Metler Toledo P1303电子分析天平(上海梅特勒—特利多有限公司生产);恒温培养箱(上海智城分析仪器公司生产);OLYMPUS BH-2荧光显微镜(日本OLYMPUS公司生产);LEICA RM2135型切片机(德国LEICA公司生产);XZC-ZB 型自控热板仪(山东省医学科学院制造);甩尾痛觉测试仪(美国ITC公司生产)。

2 研究方法

2.1 镇痛作用

2.1.1 大鼠辐射热刺激实验[1] SD大鼠48只,随机分为4组,即模型组、布洛芬组(0.03 g·kg-1)

和金关片高、低剂量组(1.0 g·kg-1、0.5 g·kg-1),

每组12只。各组大鼠灌胃0.5 mL相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水。经辐射热仪照射大鼠尾部致痛,以甩尾作为疼痛反应指标。将大鼠分别置于特制的固定圆筒内,鼠尾自然下垂,大鼠稍经训练即能保持安静以备实验。测痛时漏斗外口紧贴鼠尾,用电子秒表记录从照射开始至出现甩尾的时间,作为痛阈值。连测2 次(间隔30 s),取平均值作为基础痛阈值。选痛阈5 s左右的大鼠供实验用,< 3 s或 > 10 s表示动物反应过敏或迟钝, 舍弃不用。给药后1 h测定痛阈值,连测2次。测试中,若照射12.5 s仍不甩尾时,立即中断照射,以免局部烫伤,并以12.5 s计。

2.1.2 小鼠热板法实验[2] 昆明种小鼠48只,随机分为4组,即模型组、布洛芬组(0.04 g·kg-1)和金关片高、低剂量组(1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1),每组12只。各组动物灌胃0.5 mL相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水。以小鼠舔后足为疼痛反应指标测定小鼠痛阈值(即小鼠放入热板测痛仪内到出现舔后足反应的时间)。选择痛阈值在5~13 s

之内的小鼠。实验前测定各小鼠痛阈值2次(间隔30 s),取平均值为其基础痛阈值。给药后1 h测定各小鼠的痛阈值,超过60 s者以60 s计。

2.1.3 小鼠醋酸扭体实验[3] 昆明种小鼠48只,随机分为4组,即模型组、吲哚美辛组(0.01 g·kg-1)和金关片高、低剂量组(1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1),每组12只。各组动物灌胃0.5 mL相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水,连续灌胃给药5 d。于末次给药后30 min,每只小鼠腹腔注射质量浓度0.6%的醋酸0.1 mL·(10 g)-1,记录注射后20 min

内各鼠出现扭体反应的次数。

2.2 抗炎作用

2.2.1 小鼠腹腔毛细血管通透性实验[4] 昆明种小鼠48只,随机分为4组,即模型组、强的松组(0.002 g·kg-1)和金关片高、低剂量组(1.2 g·kg-1、

0.6 g·kg-1),每组12只。每天各组动物灌胃0.5 mL

相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水,连续灌胃给药5 d。末次给药后30 min,各小鼠尾静脉注射质量浓度0.5%的伊文思兰溶液0.1 mL·

(10 g)-1,随即腹腔注射质量浓度0.6%的醋酸溶液0.1 mL·(10 g)-1,20 min后脱颈处死,剪开腹部皮肤肌肉,用6 mL生理盐水分3次洗涤腹腔,吸管吸出洗涤液,合并后加生理盐水至10 mL,置3 000 r·min-1离心机内离心15 min;取上清液于590 nm比色测定OD值。

2.2.2 小鼠梭甲基纤维素囊中白细胞游出实验[5] 昆明种小鼠48只,随机分为4组,即模型组、吲哚美辛组(0.01 g·kg-1)和金关片高、低剂量组

(1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1),每组12只。每天各组动物灌胃0.5 mL相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水。各组给药3 d后在无菌操作下向小鼠背部皮下注入空气1 mL,形成一个近圆形气囊,次日向囊内注入质量浓度1.5%的梭甲基纤维素钠溶液1 mL致炎。于致炎后8 h从囊内吸取液体20 μL,

加入到生理盐水0.4 mL中,混匀,用微量移液器取10 μL作白细胞计数,以104·mL-1表示。

2.2.3 角叉菜胶致小鼠足肿胀实验[6] 昆明种小鼠48只,随机分为4组,即模型组、吲哚美辛组(0.01 g·kg-1)和金关片高、低剂量组(1.2 g·kg-1、

0.6 g·kg-1),每组12只。每天各组动物灌胃0.5 mL

相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水,连续灌胃给药5 d。各组末次给药l h后于小鼠右侧足掌心皮下注射质量浓度1%角叉菜胶每只30 μL,4 h

后沿踝关节剪下左右两侧后足,精密称质量(mg),以两侧足质量差为肿胀度。

2.2.4 小鼠棉球肉芽肿实验[7] 昆明种小鼠48只,随机分为4组,即模型组、吲哚美辛组(0.01 g·kg-1)

和金关片高、低剂量组(1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1),每组12只。每天各组动物灌胃0.5 mL的相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水,连续灌胃给药5 d。乙醚麻醉,在各鼠的背部正中央去毛并用质量浓度75%的乙醇消毒,然后用手术剪刀开0.5 cm

长的小口,用眼科镊子将已精密称质量为10 mg的灭菌棉球(称质量后在质量浓度75%的乙醇中浸泡消毒并干燥)从小切口植入皮下,并在切口上撒适量的青霉素以防止伤口感染,之后用手术针缝合小鼠皮肤。然后随机分成4组,给药同上述实验,从手术当天开始,灌胃给药每日1次,连续5 d。末次给药后5 h脱颈处死小鼠,用剪刀和镊子打开原切口,将棉球连同周围结缔增生组织一起取出,剔除脂肪组织,放入烘箱中60 ℃烘干8 h,称质量(mg)。将称得的质量减去棉球原质量即得肉芽肿的质量。

2.2.5 大鼠巴豆油性气囊肿实验 SD大鼠48只,随机分为4组,即模型组、吲哚美辛组(0.01 g·kg-1)

和金关片高、低剂量组(0.6 g·kg-1、1.2 g·kg-1),每组12只。大鼠背部皮下注射20 mL空气,立即向气囊内注入质量浓度1%巴豆油l mL致炎,24 h后抽出空气。致炎后每天各组动物灌胃0.5 mL相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水,连续灌胃给药5 d。末次给药8 h后处死大鼠,剥离囊壁肉芽肿,并用生理盐水反复漂洗干净,在60 ℃烘箱中干燥8 h,用分析天平精密称质量(mg)。

2.2.6 大鼠胸膜炎实验 SD大鼠48只,随机分为4组,即模型组、吲哚美辛组(0.01 g·kg-1)和金关片高、低剂量组(0.6 g·kg-1、1.2 g·kg-1),

每组12只。预先给予各组动物灌胃0.5 mL相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水。2 d后向胸膜腔内注射角叉菜胶溶液(0.2 mL,10 mg·mL-1)致炎;致炎4 h 后将其处死,打开胸腔,吸取胸腔渗出液,测定白细胞数。

2.3 小鼠肾上腺质量和维生素C含量测定实验[8]

昆明种小鼠36只,随机分为3组,即空白对照组,金关片高、低剂量组(1.2 g·kg-1,0.6 g·kg-1),

每组12只。每天各组动物灌胃0.5 mL相应受试药物,模型组给予等容积生理盐水,连续灌胃给药5 d。末次给药后快速处死小鼠,取其肾上腺精密称质量,并用维生素C试剂盒测定每个肾上腺中维生素C的含量。

2.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以表示,组内前后比较采用配对t检验,多组间均数比较用单因素方差分析,以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组对大鼠辐射热刺痛阈值影响 金关片低、高剂量及布洛芬能提高大鼠辐射热刺激阈值

(P < 0.05),提示金关片和布洛芬都能抑制大鼠辐射热刺所致的疼痛反应,见表1。

3.2 各组对小鼠热板法痛阈值的影响 金关片低、高剂量及布洛芬能提高小鼠热板法痛阈值(P < 0.05),

提示金关片和布洛芬都能抑制小鼠热板法痛阈值所致的疼痛反应,见表2。

3.3 各组对醋酸所致小鼠扭体次数的影响 金关片低、高剂量组及布洛芬组的小鼠在20 min内扭体次数平均比空白对照组明显减少(P < 0.05),提示金关片和布洛芬都能抑制小鼠醋酸刺激所致的疼痛反应,见表3。

3.4 各组对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 与模型组比较,金关片低、高剂量及强的松组的OD值均显著减少(P < 0.05),提示金关片和强的松对冰醋酸所致小鼠毛细血管通透性的增高有明显抑制作用,见表4。

3.5 各组对小鼠梭甲基纤维素囊中白细胞游出数目的影响 金关片能抑制小鼠梭甲基纤维素囊中白细胞的游出,降低囊中白细胞的数目,与模型组比较,差异有统计学意义(P < 0.01)。说明金关片能抑制炎症中期白细胞的游走,见表5。

3.6 各组对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响 金关片对角叉菜胶致小鼠足肿胀有显著的拮抗作用,与模型组比较,差异有统计学意义(P < 0.05),见表6。

3.7 各组对小鼠棉球肉芽肿形成的影响 金关片能抑制小鼠棉球肉芽肿的形成,与模型组比较,差异有统计学意义(P < 0.01)。说明金关片对炎症晚期的纤维组织增生有抑制作用,见表7。

3.8 各组对大鼠巴豆油性气囊肿形成的影响 与模型组比较,金关片能抑制大鼠巴豆油性气囊肿形成,差异有统计学意义(P < 0.01)。说明金关片对炎症晚期的结缔组织增生有一定的抑制作用,见表8。

3.9 各组对胸膜炎大鼠胸腔渗出液中白细胞数量的影响 与模型组比较, 致炎前预先给予吲哚美辛或金关片的各组大鼠胸腔渗出液中的白细胞数量明显减少(P < 0.01),见表9。

3.10 各组对正常小鼠肾上腺质量和维生素C含量的影响 金关片对小鼠肾上腺重量没有明显的影响,与模型组比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。金关片高、低剂量组大鼠肾上腺中维生素C的含量低于模型组,差异有统计学意义(P < 0.05),见表10。

4 讨 论

疼痛与炎症是类风湿关节炎、强直性脊柱炎等疾病中最常见的临床症状,因此,镇痛与抗炎成为最主要的对症治疗手段。金关片方中雷公藤祛风除湿,活血通络,消肿止痛;细辛可治百节拘挛,风湿痹痛。两药同用,药雄力峻,循经入络,直达病所,搜剔顽痰,以袪邪,共为君药。桂枝、秦艽、桑枝3种药均为治疗痹证常用之品,3种药寒热并用,意在宣通透达,解寒热错杂之症,助君药以剔逐痼结之邪,同为臣药。黄芪、山药、茯苓、薏苡仁以益气健脾,利水化湿;制附子、淫羊藿、枸杞子、黄精、鹿角霜、川续断、牛膝等阴阳共进,补益肝肾,强筋健骨,还可增强对雷公藤、细辛之毒性的耐受力,防其毒伤正之弊,共为佐药。鸡血藤、丹参顾及气血,活血通络,祛痰生新,共为使药。诸药配合,共奏止痛祛寒、活血通络、补益肝肾之效。现代药理研究表明,雷公藤具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用[9],细辛、桑枝、秦艽、桂枝、附子、薏苡仁、川牛膝具有明显的镇痛抗炎作用[10-14],鸡血藤、丹参具有抗炎、改善微循环的作用[15],淫羊藿具有促成骨、抗炎症、抗肿瘤等作用[16]。

本项研究采用经典的疼痛、炎症模型,重点观察了金关片的抗炎和镇痛作用。结果显示,金关片具有较强的镇痛抗炎作用,能显著减少醋酸所致的小鼠扭体次数,提高实验动物疼痛阈值;同时,能够显著地抑制醋酸诱导的小鼠腹腔毛细血管通透性,抑制炎症中期白细胞游走,拮抗角叉菜胶所致的足肿胀,抑制小鼠棉球肉芽肿的形成,抑制大鼠巴豆油性气囊肿的形成,抑制大鼠胸膜炎症,对抗以毛细血管扩张、通透性增加、渗出性水肿为主的急性炎症反应。此外研究还发现,金关片高、低剂量组大鼠肾上腺中维生素C含量明显低于模型组,维生素C是合成体内类激素的前体,其含量降低提示肾上腺皮质活动增强。因此提示金关片抗炎镇痛作用,其作用机制可能与增强肾上腺皮质腺功能有关。

类风湿关节炎主要表现多为关节滑膜炎性细胞浸润、血管翳形成、软骨及骨组织侵蚀等病理变化,今后设想重点研究金关片对关节炎模型鼠的滑膜、软骨及骨的保护作用及免疫系统调节作用。

5 参考文献

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