乳腺癌微血管密度与转移和预后的关系

刘大刚　杨芳　佘沅轩　李婵

【摘要】目的：探讨乳腺癌中微血管密度（MVD） 与转移.预后.组织学分型的关系，MVD采用内皮细胞标记（CD34）或血管内皮因子（VⅢ因子）标记的可行性。方法 应用免疫组织化学EnVision二步法（Dako EnVisionTM Kit）标记 CD34、Ⅷ因子检测乳腺癌MVD。结果VⅢ因子标记116例乳腺癌的MVD平均值是12.88±2.51，CD34 标记116例乳腺癌MVD平均值是13.45 ±2.74，MVD值与淋巴结转移显著相关（p<0.01）；Ⅷ因子标记的MVD值与CD34 标记的MVD值呈正相关（F检验的结果为；F>>F0.99 （1，114）；MVD值与五年生存期呈负相关（p<0.01），MVD值与组织学类型无关（p<0.05）。结论 乳腺癌MVD值与肿瘤的转移和生存期关系密切，可以作为一项独立的预后指标；MVD值既可以用CD34 标记又可以用Ⅷ因子标记。

【关键词】乳腺癌；转移；组织分型；预后；免疫组织化学

【中图分类号】R271.44【文献标识码】A【文章编号】1004-4949（2013）09-42-03

乳腺癌是一种高度异质性的疾病[1]。近年来，国内外文献报道恶性肿瘤的转移和预后与微血管数（microvessl density，MVD）有关，但是有关乳腺癌MVD与其预后关系，目前仍存在争议，一些研究认为微血管数定量可以作为乳腺癌预后判断的指标[2-8]。也有人认为MVD不能预测癌的复发与预后[9]。为此，我们采用血管内皮因子（Ⅷ因子）和内皮细胞标记（CD34）检测116例乳腺癌的MVD，并对有完整随访资料的46例进行分析，进一步探讨乳腺癌MvD值与转移、预后组织学分型的关系，以期更好地为临床治疗和判断预后提供依据。

1材料和方法

1.1标本来源：所有病例选自昆明医科大学附属延安医院，按下列程序和方法筛选病例。（1）选自 2002～2012年间行乳腺癌根治术和改良根治术的116例，其中46例有完整的随访资料，从术后随访到死亡，存货病例随访5年以上未见复发或者转移征象，最长达10年。（2）有肿瘤原发灶蜡块保存。（3）对乳腺癌组织类型按照WHO进行分类。（4）作为Ⅷ因子相关抗原和CD34检测。116例患者均为女性，年龄29～83岁，平均为44.5岁；手术时无腋窝淋巴结转移者46例（其中有随访资料的21例中，5年内死亡的为6例）；手术时无腋窝淋巴结转移者70例（其中有随访资料的25例中，5年内死亡的为1例，5年后尚未死亡的10例）；在46例有完整的随访资料的病例中，有29例为手术后未满5年而且尚未死亡者。

1.2实验试剂和方法：用常规石蜡切片做Ⅷ因子和CD34检测，一抗为鼠抗人单克隆抗体（Kit-9701），工作浓度为即用型，监测系统为：链霉素抗生素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒（Dako EnVisionTM 二步法Kit，丹麦基因生物技术开发公司），按说明书操作方法进行，显色剂为DAB。

1.3Ⅷ因子、CD34标记的MVD值：指癌巢间及癌巢周围染棕黄色的单个内皮细胞或者内皮细胞簇为一个血管标记，参照Bosasi[6]和Kolkman[7]的标准，在400倍的视野下选择微血管数最多的5个视野进行计数，每例切片先后计数两次，求平均值。

1.4组织学分型方法：根据组织发生和形态结构将乳腺癌分为导管癌、小叶癌和特异性癌三大类。

1.5将Ⅷ因子和CD34标记的MVD用线性回归分析检测她们的相关关系。

1.6统计学处理：各组数据平均值采用X±S表示，用T检验，线性回归采用F检验。

2结果

2.1用Ⅷ因子标记的116例乳腺癌患者的MVD平均值是12.88±2.511，有淋巴结转移的46例乳腺癌患者的MVD平均值是14.51±2.67，无淋巴结转移的70例乳腺癌患者的MVD平均值为11.80±1.70，两者相差显著（p<0.01），MVD值与淋巴结转移呈正相关；5年内死亡者MVD值为15.14±1.79，存活5年以上者MVD值为11.32±1.07，两者相差显著（p<0.01），且与5年以上生存期呈负相关；组织学分型与MVD无显著性差异（p>0.05）.

2.2用CD34标记的116例乳腺癌患者的MVD平均值是13.45±2.74，有淋巴结转移的46例乳腺癌患者的MVD平均值是15.47±2.67，无淋巴结转移的70例乳腺癌患者的MVD平均值是12.12±1.83.两者相差显著（p<0.01），MVD值与淋巴结转移呈正相关；5年内死亡者MVD值为15.74 ±1.62，存活5年以上者MVD值为12.02±1.22，两者相差显著（p<0.01），也与5年以上生存期呈负相关；组织学分型与MVD无显著性差异（p>0.05）.

2.3116例乳腺癌患者，采用Ⅷ因子和CD34标记的MVD值之间呈显著线性正相关（F=97.7，远远大于F0.99（1，114）+6.96），其线性回归方程式：y=4.54+0.62x（注x代表CD34表达的MVD值，y代表Ⅷ因子表达的MVD值），统计结果见附表。

附表MVD与淋巴结转移、5年生存期、组织学分型的关系

MVQ的表达1分组1例数1MVD（个，X±S）1T值1P值Ⅷ因子

2讨论

乳腺癌是中年妇女最常见的恶性肿瘤，预后较差，其中血行和淋巴的转移是患者死亡的主要原因。因此，迫切需要寻找一种简单可行的以预测乳腺癌的转移及判断愈后指标，辅助指导临床的治疗。为此我们重点观测乳腺癌的肿瘤性血管生成与患者预后的关系，及肿瘤微血管密度与乳腺淋巴一血路转移的相关性。

现已研究表明，实体肿瘤的生长是血管依赖性的，血管作为肿瘤间质中的一种重要成分与肿瘤细胞互相作用，构成完整的微生态系统。肿瘤细胞产生多种细胞因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）促成血管生成；而血管内皮细胞也可以分泌多种细胞因子，促进肿瘤细胞的恶性转化和加速增殖[10]，微血管生成还与浸润性肿瘤内激活的巨噬细胞和肥大细胞以及活化的淋巴细胞有关[7].由于新生的微血管发育不成熟，管壁仅为一层常有裂隙的内皮细胞，缺乏基底膜，但又由于内皮细胞分泌的纤维蛋白溶解酶的作用，使肿瘤细胞容易进入微血管，经血循环在远处器官形成转移灶[4，6，7].另一方面，微血管形成过程中，内皮细胞要产生多种基质降解酶，也可破坏基质屏障，促进肿瘤细胞转移，本组116例乳腺癌患者中，有淋巴结及其他脏器转移者46例，无转移者70例，有转移的患者MVD值显著大于无转移患者的MVD值（p<0.01）.由此可见微血管生成可能是包括乳腺癌在内的多种肿瘤侵袭转移的一个重要标志物。

肿瘤的浸润、转移和复发是造成患者死亡的重要原因之一，无论原发肿瘤还是转移瘤的形成和生长，均依赖于血管形成，因此，血管生成数越多，肿瘤生长速度越快，转移几率越高[10～12]。本组有随访的46例病人中，5年内死亡的7例，存活5年以上的10例，存活者的MVD值显著的小于死亡者的MVD值（p<0.01）。即微血管密度越大生存期越短，微血管密度越小生存期越长。因此，我们有理由提出，对乳腺癌组织进行MVD标记检测，将可能成为判断恶性程度及其预后的一本指标，但是由于随访5年生存及5年死亡的例数较少，尚有待进一步积累资料深入研究。研究中发现组织类型与血管生成数没有相关性。

在本研究中，我们采用人原始造血细胞抗原CD34 （human hematopietic progenitor cell antige CD34 ），显示血管内皮细胞。该抗体染色强度深，且背景清晰，而且对癌内微血管，以及尚未形成的管腔的新生血管内皮细胞，均有较强的染色（图1），有利于准确计算MVD值。另外，我们还采用血管内皮相关抗原Ⅷ因子标记微血管，以及尚未形成的管腔的新生血管内皮细胞（图2），两者检测血管的结果基本一致，但我们认为CD34标记优于Ⅷ因子，若两者染色相结合观察所得之结果更准确。

目前有些研究表明，使用血管抑制剂治疗实体瘤已经取得了显著的临床效果。本研究结果不仅表明MVD与乳腺癌转移、预后有关，也为乳腺癌的病人抗新生血管的形成治疗提供了治疗依据。

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