冷冻超薄切片免疫电镜技术在肾活检病理中的应用

免疫电镜技术是利用抗原与抗体特异性结合的原理,在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法,为精确定位各种抗原的存在部位及分布，研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效技术手段[1]。基于Tokuyasu技术及其改良技术发展起来的冷冻超薄切片免疫电镜技术兼顾了组织超微结构和抗原保存,免疫标记特异度强、敏感度高等诸多优势而代表着免疫电镜技术发展的方向[2-7]。本文通过冷冻超薄切片免疫电镜技术应用于肾活检病理免疫沉积物、细胞表面抗原及细胞内抗原标记,明确其性质及其精确定位研究,并对影响冷冻超薄切片免疫电镜技术相关因素进行探讨,为肾脏疾病发病机制探讨、阐明病因提供可靠依据,为肾脏疾病临床和基础科研提供相应的技术基础。

材料与方法

标本选取选取南京军区南京总医院全军肾脏病研究所肾活检标本IgA肾病5例，轻链沉积病2例，糖尿病肾病5例，膜性肾病1例,肾活检标本均经光镜、免疫荧光和常规电镜明确诊断。

方法所选肾活检标本经冷冻超薄切片后进行免疫染色,并与Epon812、LR White Resin免疫电镜方法对比观察超微结构、免疫标记(表1)。

冷冻超薄切片免疫电镜

冷冻超薄切片取材与固定：将肾组织块切成1 mm3的小块,放入含2%(w/v)甲醛和0.02%(v/v)戊二醛(pH 7.4)0.1 mol/L PBS固定剂中,室温固定2h,将固定好的组织块用PBS缓冲液清洗两次,每次10 min,再将其投入到含有10%明胶溶液中渗透15 min；冷冻保护处理:将明胶包埋的肾组织块投入到2.3 mol/L蔗糖的0.1 mol/L PBS缓冲液中室温下渗透2h,使蔗糖充分渗透到组织块中。冷冻超薄切片：使用Leica EM FC6冷冻超薄切片机参照Tokuyasu技术进行冷冻切片,半薄切片时将切片机冷冻室温度调节至-80℃,厚度约为250 nm,经甲苯胺蓝染色后光镜下进行肾小球定位和复温后进行免疫荧光标记。冷冻超薄切片时将切片机冷冻室温度设置为-120℃,厚度约为90 nm,同时调节好静电发生器(Antistatic)的功率,避免切片发生压缩、卷曲,切出一定长度连续平整的超薄片之后,使用蘸有甲基纤维素-蔗糖保存液MCS(含1.5%～2%甲基纤维素,1.5 mol/L蔗糖溶液)迅速地将切片黏出,转移到覆有formvar膜的镍网上。切片保存在4℃冰箱或复温后进行免疫标记。

表1 不同免疫电镜方法

免疫标记冷冻超薄切片复温后,0.1 mol/L PBS缓冲液冲洗切片3次,5 min/次,5%BSAc孵育15 min以阻断非特异性背景着色,适当浓度的一抗[IgA (1∶500兔抗人 DAKO)、κ(1∶200兔抗人 DAKO)、λ(1∶200兔抗人 DAKO)、C3aR(1∶200兔抗人Santa cruz)、Podocine(1∶100 兔抗人Santa cruz)、Nephrin(1∶100 兔抗人Santa cruz；鼠抗人 日本河内裕)]4℃冰箱孵育过夜,空白对照组使用PBS缓冲液代替,0.1 mol/L PBS缓冲液冲洗切片3次,5 min/次,二抗胶体金抗体(羊抗兔,羊抗鼠IgG gold,10 nm,AURION GOLD REAGENTS)室温孵育2h,缓冲液充分冲洗切片,1%戊二醛固定10 min,蒸馏水充分冲洗切片,2%(w/v)甲基纤维素溶液和0.4%(w/v)酸性醋酸铀溶液按9∶1的比例新鲜配制染色5 min,切片干燥后Hitach 7500透射电镜下观察和拍照。

Epon812常规免疫电镜 肾组织块用常规3.75%戊二醛和1%锇酸双固定,脱水、浸透、包埋,厚约70 nm超薄切片,覆有formvar膜的镍网捞片。切片室温下10% H2O2蚀刻10 min,0.1 mol/L PBS缓冲液冲洗切片3次,5 min/次,5%BSAc孵育15 min以阻断非特异性背景着色,适当浓度的一抗(同上)4℃冰箱孵育过夜,空白对照组用PBS缓冲液代替,0.1 mol/L PBS缓冲液冲洗切片3次,每次5 min,二抗胶体金抗体(同上)室温孵育2h,蒸馏水充分冲洗切片,醋酸铀染色5 min,柠檬酸铅染色10 min,切片干燥后Hitach 7500透射电镜下观察和拍照。

LR White Resin低温包埋免疫电镜 肾组织块放入2%(w/v)甲醛和0.02%(v/v)戊二醛0.1 mol/L PBS混合固定液中,室温固定2h,梯度乙醇脱水,浸透、LR White Resin包埋,45℃聚合48h。厚约70 nm超薄切片,覆有Formvar膜的镍网捞片。切片不经10% H2O2蚀刻,余下步骤与Epon812常规免疫电镜免疫标记相同。

免疫荧光标记 肾组织块-80℃冷冻半薄切片后转移至玻璃盖玻片,切片复温后进行免疫标记：0.1 mol/L PBS缓冲液冲洗切片3次,5 min/次；5%BSAc孵育15 min以阻断非特异性背景着色；适当浓度的一抗(同上)室温孵育1.5h,空白对照组使用PBS缓冲液代替；缓冲液清洗3次,5 min/次；加入荧光标记的二抗孵育1h,缓冲液清洗3次,5 min/次；甘油封片后移至荧光显微镜下观察和拍照。

结 果

超微结构Epon812常规电镜技术对肾组织、细胞超微结构保存良好,尤其是细胞内结构如微管、内质网、细胞基质精细结构,电镜下细胞器膜性结构显示清晰(图1A、B)；LR White Resin树脂包埋法肾组织精细结构整体固定效果满意,细胞内微管、糖原及细胞基质保存较好,膜性肾病电子致密物反差较常规方法高,电子致密物和电子透亮区界限显示更清楚,但内质网、线粒体等细胞器膜性结构显示不够清晰,保存不如常规Epon812方法(图1C、D)。肾组织冷冻超薄切片镜下观察细胞形态、细胞内结构变化较小,高倍镜下显示细胞器如线粒体脊和质膜、足细胞裂孔膜结构保持较完整,内质网、线粒线外膜边缘更平滑。但是细胞内基质、糖原保存不理想(图1E、F)。

标记率IgA肾病肾组织半薄冷冻切片行免疫荧光染色显示IgA呈团块状沉积于系膜区(图2A)。LR White Resin低温包埋法、冷冻超薄切片法标记结果理想,即使是常规Epon812方法系膜区电子致密物沉积区仍可见散在金颗粒分布,周围背景着色较低(图2B)；LR White Resin树脂包埋法则显示金颗粒特异性分布于电子致密物内,阳性部位金颗粒的分布密度比常规方法高,且背景干净(图2C),相同的一抗、二抗稀释度条件下,冷冻超薄切片免疫标记显示阳性部位金颗粒密度最高,IgA沉积部位定位准确,分布特异度、敏感度最高且背景干净(图2D)。

轻链沉积病(κ和λ型轻链沉积病)肾组织半薄冷冻切片行免疫荧光轻链(κ、λ)染色显示,κ、λ轻链弥漫分布于系膜区、肾小球基膜及肾小管基膜上。肾组织冷冻超薄切片免疫电镜κ、λ免疫标记,显示及定位效果很好,金颗粒沿着肾小球基膜内侧和肾小管基膜特异性分布,标记密度高(图3A～C),而LR White Resin树脂包埋法特异度和敏感度都低于冷冻超薄切片法,Epon812常规免疫电镜方标记率则更低。

图1 肾组织基膜和线粒体超微结构(EM)

图2 肾组织IgA免疫电镜染色结果

冷冻超薄切片法对肥大细胞内抗原C3aR的标记效果满意,C3aR在分泌溶酶体内特异性表达,金颗粒标记密度高、背景干净,很好地显示了其表达特点(图3D、E)。在对细胞膜抗原和细胞内骨架蛋白如足细胞相关蛋白Podocine、Nephrin进行免疫电镜标记研究中发现,常规免疫电镜法和LR White Resin树脂包埋法免疫标记为阴性,LR White Resin树脂包埋法金颗粒标记表现为弱阳性或阴性,很难达到准确定位、定量的目的,而超薄冷冻切片免疫电镜染色显示Podocine特异性表达于足细胞和裂孔隔膜且金颗粒标记密度较高(图3F)。值得注意的是，抗体的质量是影响免疫标记的重要因素,单克隆与多克隆抗体在抗体效价和敏感性存在明显的差异,通过对比发现,相同的一抗、二抗稀释度条件下,多克隆兔抗人Podocine、Nephrin抗体金颗粒标记密度远高于单克隆抗体,而后者金颗粒分布明显散在、稀疏。

图3 肾组织λ、C3aR、Podocine超薄冷冻切片免疫电镜染色结果

讨 论

近年来，免疫电镜技术在科研应用中越来越广泛，而在肾活检免疫电镜研究中,为了获得较好的固定效果，标本处理过程中组织抗原遭到不同程度的破坏,从而影响抗原活性，导致标记效果不理想，或者为了获得较好的抗原表达，减少对组织处理，又影响其超微结构，以上原因制约了免疫电镜在临床诊断中的应用。与Epon812常规免疫电镜技术、LR White Resin低温包埋免疫电镜技术相比,基于改良的Tokuyasu技术发展起来的冷冻超薄切片免疫电镜技术的最大特点是轻微化学固定,冷冻保护,兼顾了组织超微结构和抗原的保存,可以提高免疫标记阳性率,非特异性背景减低,重复性好,结果可靠。我们的研究证实，冷冻超薄切片免疫电镜技术在保存一定超微结构的基础上，标记效率和定位均较常规免疫电镜和LR White Resin低温包埋免疫电镜方法明显提高，可作为肾脏疾病诊断及科研研究的一种重要手段。其次经冷冻保护过的肾组织可在液氮或超低温冰箱(-80℃)冷冻组织样本库中长期保存，为回顾性研究提供方便。

冷冻超薄切片免疫电镜技术优势与常规树脂包埋免疫电镜技术不同,冷冻超薄切片法所取组织块在-80～-120℃低温下冷冻达到足够的硬度直接完成超薄切片,切片复温至室温后再进行免疫标记,在整个标本处理过程中生物分子都保存在水环境中,超微结构接近生理状态,能够更理想地保存一些生物大分子的活性。由于没有树脂包埋剂的交联反应,超薄切片容易暴露更多的抗原,免疫标记敏感性增强,背景着色低。此外染色液甲基纤维素-醋酸铀使切片有良好的反差,并提供表面支持而避免切片干燥变形[8],特别是应用甲基纤维素-蔗糖作为捞片和保存液,冷冻超薄切片的细胞膜性结构得到良好的保存[9]。一般情况下冷冻超薄切片免疫电镜的敏感度是其他方法的数倍,一些易损抗原和含量少的抗原也能较好免疫标记和定位[10]。本研究也证实，冷冻超薄切片法能很好保存抗原，标记效果好，值得推广应用。同时也应注意冷冻超薄切片免疫电镜技术的一些不足，如冷冻超薄切片设备要求高，切片具有一定的技术难度，要保存的样本需要样品前化学固定等。通过练习掌握冷冻超薄切片技巧，优化样品前化学固定方法，冷冻超薄切片免疫电镜技术可肾活检病理及科研中发挥更大的优势。

最佳实验条件及实验体会

样品预处理 免疫电镜技术的理想目标是既能将抗原准确定位,又能观察到近似于生活状态下的细胞超微结构。为了避免冷冻超薄切片从冷冻环境向室温环境转移的过程中遭到结构破坏,标本组织必须选择合适的固定剂和固定系统进行化学固定,研究表明不同抗原的稳定性不同,不同固定剂对抗原物质的影响亦存在明显差异,Stierhof等[11]和Ripper[12]等通过甲醛、戊二醛的单独使用和联合使用,以及其浓度和固定时间对免疫标记影响的比较研究,发现甲醛浓度2%～4%、戊二醛浓度0.02%～0.05%,对免疫标记效率影响最小,又能达到较好固定组织的效果。本研究采用2%甲醛+0.02%戊二醛固定系统取得了较好的效果。组织块大小则以1 mm×1 mm×1 mm为宜,取材组织过大不利于2.3 mol/L蔗糖充分渗透,未渗透部分在冷冻切片时易产生冰晶造成切片空洞和无法切片。

冷冻超薄切片 冷冻超薄切片耗时长、技术要求高,获得连续、理想的冷冻超薄切片并非易事,除了前期适当的标本固定、冷冻保护处理外,操作者需要反复练习，应充分考虑到冷冻超薄切片脆弱性,贴片和切片转移操作要轻巧,防止对样品的挤压损伤和减少人为假象。Liou[13]用甲基纤维素和蔗糖混合液MCS(含1.5%～2%甲基纤维素,1.5 mol/L蔗糖溶液)代替蔗糖捞片溶液(切片易碎，不易保存),本研究采用上述方法也获得了保存良好的组织超微结构,冷冻超薄切片可长时间保存而又不影响免疫标记。

免疫标记 影响免疫标记的因素主要包括：冷冻超薄切片质量、免疫标记的特异性和敏感性、非特异背景和切片反差。良好的冷冻超薄切片是正确判断染色结果的基础和前提。影响切片质量的因素包括样品预处理固定不佳、冷冻保护蔗糖渗透不充分、液氮或-80℃冷冻时组织容易产生冰晶、切片空洞和碎组织挤压，以上因素都都会导致非特异背景染色[14]。鉴于此，必须重视标本的前期处理和提高冷冻超薄切片质量。冷冻超薄切片免疫电镜技术一个主要的缺点是样品前化学固定,某些抗原标记失败,主要是由于醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子的结构[15],可通过对固定和不固定的实验样品进行免疫荧光染色,以检测和评估化学固定剂对抗体的影响。值得注意的是,某些抗原在孵育时可能发生移位,如细胞膜脂质成分、可溶性抗原在轻微化学固定或不充分的固定条件下更容易会造成抗原提取或移位[16-17],故化学固定剂种类、浓度及时间都应适当控制,以取得理想的标记结果。虽然冷冻超薄切片免疫电镜方法较其他方法非特异背景着色显著减少,但是抗体质量、非特异性抗体吸附、孵育时间,温度及PBS冲洗是否充分仍是非特异背景着色的主要原因。常用2%～10%BSA或5%脱脂奶粉作为阻断剂,使用经过乙酰化处理的5%BSA-cTM对切片封闭孵育15 min,可有效降低非特异着色。因此冷冻超薄切片免疫电镜技术影响和干扰因素较多,对于免疫标记没有出现预期结果时,应系统地查找原因。实验中必须设置阳性和阴性对照实验，以保证染色结果的可靠性,特别是对抗原含量少、标记率低的染色,应结合光镜、免疫组化、免疫荧光综合判断免疫电镜染色结果。

小结：免疫电镜是免疫化学技术与电镜技术结合的产物,作为一种在超微结构水平上定位技术手段,冷冻超薄切片免疫电镜是一门重要的技术,为生物细胞形态学的基础研究及临床诊断提供有价值的直接证据,随着其技术不断发展和完善,将在肾脏疾病临床及科研工作中有广泛的应用前景，发挥其更大的作用。

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