聚碳酸酯纳米药物的制备与性能

鄢国平，邵春桃，韩 林，邹头君，刘 凡，龚晓芸，常秀鹏

(武汉工程大学材料科学与工程学院，湖北 武汉430074;武汉工程大学绿色化工过程教育部重点实验室，湖北 武汉 430074)

0 引 言

医用高分子纳米材料作为一种新型的药物控释体系，能透过毛细血管以及组织间隙，甚至还可以通过血脑屏障而被组织细胞或器官吸收从而缓慢释放药物，达到杀伤肿瘤细胞的目的，为恶性肿瘤、病毒性流行病以及神经系统疾病等的临床治疗提供了新的给药途径[1-5]，已引起科学家的广泛关注，具有非常广阔的发展前景.

将药物包埋在高分子纳米颗粒或纳米胶束中是制备高分子纳米控释药物的一个重要的方法[6-10].纳米药物主要有两个特点：①可以对药物进行保护，使药物在进入人体的过程中不被胃酸和酶等侵蚀降解，从而提高药物的稳定性，避免全身性的毒副作用[11]；②改变载药材料的结构可以调整纳米药物的理化性质，从而达到调节药物的释放速度与释放时间的目的，真正实现对药物的缓控释效果.

一般化疗药物在体内稳定性差，毒副作用较大，存在明显的疗效-剂量的依赖关系.而纳米药物恰恰克服了这些缺点，可靶向输送药物，控制药物释放，从而延长药物的作用时间，在保证药物作用的前提下，减少药剂量，从而减轻或避免毒副作用.因此，将纳米技术用于药物的研究已是现代医学发展的重要方向之一[12].

医学研究表明，在肿瘤细胞膜表面存在高表达的叶酸受体，对叶酸衍生物具有较高亲和性，可通过受体介导方式来选择摄取叶酸衍生物，因此叶酸对肿瘤组织或细胞具有良好的生物选择性或靶向性，可以用做药物的靶向基团.本论文以叶酸为肿瘤靶向基团，以羟基化的碳酸酯共聚物P(PTC-co-DTC)[13]为高分子载体，以5-氟尿嘧啶为抗癌药物模型，采用高压电场喷雾法与透析法分别制备两种聚碳酸酯纳米抗癌药物，并进行了结构表征与性能研究.肿瘤靶向性聚碳酸酯高分子载体的具体合成路线如图1.

图1 含叶酸基团聚碳酸酯载体的合成Fig.1 Synthetic route of polycarbonate carrier containing folate groups

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

无水乙醚、二甲亚砜(DMSO)、二氯甲烷、无水甲醇、无水乙醇、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、溴乙酰溴、叶酸、氢氧化钠都为市售分析纯试剂.9-苯基-2,4,8,10-四氧螺[5,5]十一烷-3-酮与2,2-二甲基二亚甲基碳酸酯共聚物P(DTC-co-PTC)([PTC]/[DTC]=1∶1)按照文献[14]合成.

紫外-可见光谱用UNIC-2802H UV/Vis Spectrophotometer紫外光谱仪测定.傅里叶红外光谱用Nicolet iS 10 FT-IR sprctrometer型红外光谱仪测定.1H NMR用Varian Mercury VX-300(300Hz)型核磁共振波谱仪测定，溶剂为氘代CDCl3，TMS为内标.聚合物分子量及其分布用Waters凝胶渗透色谱仪进行测定，色谱柱由HR3、HR4和HR5组成，以聚苯乙烯为标样，DMF为流动相，流速为1 mL/min.检测响应由waters 2414检测器收集处理，柱温35 ℃，检测器温度35 ℃.聚合物水接触角用卓越型光学接触角测量仪(DSA100)测定.聚合物电位与粒径用Zetasizer Nano ZS分析仪测定.

1.2 碳酸酯共聚物的溴取代反应

1.79 g碳酸酯共聚物(P(DTC-co-PTC)[PTC]/[DTC]=1∶1)(5 mmol)溶于30 mL二氯甲烷，在冰水浴冷却，磁力搅拌下慢慢滴加入0.404 g溴乙酰溴(2 mmol)，同时慢慢滴加少量0.159 g吡啶(2 mmol)，继续搅拌反应4 h，再在室温下反应12 h.反应结束后，过滤除去不溶物，浓缩滤液，用无水乙醚进行重沉淀，过滤，所得固体经真空干燥得到溴代共聚物1.36 g(1.62 mmol)，产率76%.

1.3 氨基化叶酸的制备

将2.5 g叶酸(Folate, FA, 5.65 mmol)溶解于50 mL DMSO，加入1.176 g二环己基碳二亚胺(Dicyclohexylcarbodiimide, DCC, 6.215 mmol)和0.715 g N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS, 6.215 mmol)，室温下避光反应5 h.将溶液抽滤以除去不溶物，所得滤液即为FA-NHS，放于冰箱中保存待用.取7.0 mL上述FA-NHS液体缓慢滴加到0.4 mL乙二胺(EDA)中，室温下搅拌反应6 h，过滤，除去白色不溶物，所得滤液用28 mL乙醇进行重沉淀，过滤，所得固体产物用乙醚洗涤3次后，真空干燥，制得红黄色氨基化叶酸FA-EDA固体粉末产物300 mg，产率12%[14].

1.4 含叶酸基团聚碳酸酯载体的合成

将1.36 g溴代共聚物(1.62 mmol)溶解于10 mL二氯甲烷，再加入将0.966 g氨基化叶酸(2 mmol)和2 mg三乙胺(2 mmol)溶于10 mL DMSO的溶液，在40 ℃下磁力搅拌反应5 h.过滤除去不溶物，所得滤液滴入蒸馏水中进行重沉淀，过滤得黄色沉淀.将沉淀用二氯甲烷充分溶解后，过滤除去不溶物，浓缩除去溶剂，干燥得到肿瘤靶向性聚碳酸酯载体1.08 g，产率79.68%.其结构表征数据如下:

FT-IR(KBr, cm-1): 3 439.32(-OH), 2 969.56, 2 872.40(-CH2), 1 664.35(C=N), 1 476(C-C), 1 751.16(C=O), 1 101.49(C-O-C=O);UV(CH2Cl2,nm): 227, 286, 365, 476;

1H NMR(CDCl3)δ: 8.0(-CONH-),7.9(-NH-C6H5-CO-),7.3-7.4(C6H5-),5.436(-C6H5-CH-),5.1(-N=C-OH), 4.49(-NH-CH-COOH), 4.45(-CH2-NH-),4.39(-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-),4.3(-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-),4.27(-COO-CH2-C(CH2O-)2-CH2O-),4.13(-COO-CH2-CH2-CH2-),3.0(-NH-CH2-CH2-NH2),2.89(-CH2-CH2-NH2),2.7(-CH2-CONH-), 2.55(-C-CH2-), 2.035(-CH2-CH2-CH2).

1.5 透析法制备聚合物纳米药物

10 mg含叶酸靶向基团的聚碳酸酯溶于2 mL的二甲亚砜(DMSO)，再加入1 mg 5-氟尿嘧啶，待其充分溶解后，将溶液放置于透析袋中(截留分子量为8 000～12 000).将透析袋密封，置于盛满2 L蒸馏水的烧杯中进行透析，每间隔4 h更换一次蒸馏水，透析96 h后过滤，滤液冷冻干燥得到聚碳酸酯纳米药物.用适量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解冻干后的产品，用紫外-分光光度计测定其在265 nm波长下的特征吸收峰值，通过建立的标准曲线来测定载药量[15].采用Zetasizer Nano ZS粒径仪测试其粒径.

1.6 高压电场喷雾法制备聚合物纳米药物

10 mg含叶酸靶向基团的聚碳酸酯溶于2 mL的二甲亚砜(DMSO)，再加入1 mg 5-氟尿嘧啶，待其充分溶解后置于母液瓶中，采用高压电场电喷雾法(毛细管采用5号针，加正电位高压5 100V)制备聚碳酸酯纳米药物.用适量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解冻干后的产品，用紫外-分光光度计测定其在265 nm波长下的特征吸收峰值，通过建立的标准曲线来测定载药量.采用Zetasizer Nano ZS粒径仪测试其粒径.

1.7 聚碳酸酯纳米药物的体外释药性能

将1.5和1.6中制备的纳米药物分别置于装有少量磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4，0.1 mol/L，PBS)缓冲溶液的透析袋中，再将此透析袋置于盛有100 mL PBS缓冲溶液的锥形瓶中，将锥形瓶置于37 ℃恒温振荡器中振荡.每间隔半小时从锥形瓶中取出25 mL溶液，并补加25 mL PBS磷酸盐缓冲溶液.所取溶液用高效液相色谱在265 nm处测试溶液中的5-氟尿嘧啶的含量.并绘出聚碳酸酯纳米药物释放率随时间的变化曲线.

2 结果与讨论

2.1 合成与结构表征

图2 含叶酸基团聚碳酸酯的红外光谱图Fig.2 FT-IR spectrum of polycarbonate containing folate groups

图3 含叶酸基团聚碳酸酯的紫外光谱图Fig.3 UV spectrum of polycarbonate containing folate groups

碳酸酯共聚物(P(DTC-co-PTC),[PTC]/[DTC]=1∶1)与溴乙酰溴反应后得到部分羟基被溴乙酰化的共聚物，然后将氨基化叶酸接入共聚物分子，从而制得侧链含有叶酸肿瘤靶向基团与羟基的碳酸酯共聚物.并对肿瘤靶向性碳酸酯共聚物进行FT-IR、1H NMR、UV等结构表征.其红外光谱见图2.由图2可知1 641cm-1处出现的吸收峰为叶酸分子中酰胺键的特征吸收峰，叶酸分子中叠氮环上的吸收峰出现于1 607～1 529 cm-1处.从紫外光谱图(图3)可看出，叶酸分子的特征吸收峰出现于476, 365, 286, 227 nm处.在图4所示的1H NMR图谱中，横坐标为化学位移δ，δ=7.9处是叶酸分子中苯基的吸收峰，δ=5.1处是叶酸叠氮环上羟基的吸收峰，δ=7.4处是碳酸酯结构片断中苯基的吸收峰，δ=4.68处宽峰为还原后OH质子峰.结合红外光谱、紫外光谱、核磁图谱等数据表明，聚碳酸酯侧链中已成功接入了肿瘤靶向性叶酸基团.

图4 含叶酸基团聚碳酸酯1H NMR的核磁谱图(CDCl3)Fig.4 1H NMR spectrum of polycarbonate containingfolate groups in CDCl3

2.2 制备方法对聚碳酸酯纳米药物载药量的影响

通过测试，透析法制备的纳米药物载药量为13.56%(1∶0.1)，14.93%(1∶0.2)，17.08%(1∶0.4).载药量不高.分析原因可能是载药胶束比较小，透析时间比较长，透析过程中药物有损失.采用高压电场电雾化法制备纳米药物时，药物损失相对较少，载药量相对高一些，分别为18.03%(1∶0.1)，21.42%(1∶0.2)，28.63%(1∶0.4).

2.3 投料比对制备聚碳酸酯纳米药物的影响

通过Zetasizer Nano ZS粒径仪对透析法所制备的纳米药物的粒径大小进行了测试，研究了羟基化的聚碳酸酯P(PTC-co-DTC)分子结构中重复结构片段中所含羟基和溴乙酰溴摩尔投料比(mol/mol)对制备的纳米药物颗粒尺寸的影响，实验结果见表1.当碳酸酯共聚物P(PTC-co-DTC)分子结构中所含羟基和溴乙酰溴摩尔投料比从1∶0.1增加到1∶0.4，即聚碳酸酯分子中叶酸基团含量增大时，纳米药物的粒径逐渐增大.

表1 聚碳酸酯分子结构中所含羟基与溴乙酰溴投料比对透析法制备纳米药物颗粒尺寸的影响Table 1 Effect of molar feed ratio of hydroxyl group in polycarbonate/bromoacetyl bromide on nanoparticles prepared by dialysis method

注：Di、Dv和Dn是样品用蒸馏水稀释后测得的平均值.

2.4 高压电场喷雾法制备聚碳酸酯纳米药物的影响因素

采用高压电场喷雾法制备聚碳酸酯纳米药物，研究了溶液浓度、聚碳酸酯分子结构中所含羟基与溴乙酰溴摩尔投料比、液体流量和毛细管加载电压对制备的聚碳酸酯纳米药物的粒径的影响.其实验结果见表2、表3.

表2 聚碳酸酯分子结构中所含羟基与溴乙酰溴投料比对高压电场喷雾法制备纳米药物颗粒尺寸的影响Table 2 Effect of molar feed ratio of hydroxyl group in polycarbonate/bromoacetyl bromide on nanoparticles prepared by high voltage electric atomization

注：电压为4 254V, 液体流量为1.01 mL/h, 聚合物浓度为1 mg/mL.

表3 电压，液体流量和聚合物浓度对高压电场喷雾法制备纳米药物的影响Table 3 Effect of voltage, liquid flow and polymer concentration on nanoparticles prepared by high voltage electric atomization

当聚碳酸酯分子结构中所含羟基和溴乙酰溴摩尔投料比从1∶0.1增大到1∶0.4时，纳米药物的粒径逐渐增大.当毛细管的加载电压增大或样品浓度降低时，纳米药物的粒径逐渐减小.而样品的输入流量增大时，纳米药物粒径也会变大.与透析法制备的纳米药物相比，高压电场喷雾法制备的纳米药物具有明显小的粒径.

2.5 肿瘤靶向性聚碳酸酯纳米药物的体外释药性能

透析法制备的聚碳酸酯纳米药物体外5-氟尿嘧啶控制释放实验结果如图5所示.以聚碳酸酯P(PTC-co-DTC)分子结构中所含羟基和溴乙酰溴摩尔比为1∶0.1，1∶0.2，1∶0.4投料，所得的肿瘤靶向载体制备的纳米抗癌药物在体外PBS磷酸盐缓冲溶液中经过37天释放后，5-氟尿嘧啶累积释放率分别达到85.31%，77.79%和70.58%.

高压电场喷雾法制备的聚碳酸酯纳米药物体外5-氟尿嘧啶控制释放实验结果如图6所示.以聚碳酸酯P(PTC-co-DTC)分子结构中所含羟基和溴乙酰溴摩尔比为1∶0.1，1∶0.2，1∶0.4投料，所得的肿瘤靶向载体制备的纳米抗癌药物在体外PBS磷酸盐缓冲溶液中经过37天释放后，5-氟尿嘧啶累积释放率分别达到95.42%，92.66%和88.37%.

实验结果表明，高压电场喷雾法制备的纳米药物比透析法制备的纳米药物的5-氟尿嘧啶释放速率快.

图5 透析法制备的纳米药物中5-氟尿嘧啶的释放曲线(PBS缓冲液，37 ℃)Fig.5 Release profiles of 5-Fu from nanoparticles prepared by dialysis in PBS at 37 ℃

图6 高压电场喷雾法制备的纳米药物中5-氟尿嘧啶的释放曲线(PBS缓冲液，37 ℃)Fig.6 Release profiles of 5-Fu from nanoparticles prepared by high-voltage electrostatic field-assisted atomization in PBS at 37 ℃

3 结 语

将叶酸通过化学反应键连在羟基化的聚碳酸酯P(PTC-co-DTC)的侧链羟基上，从而合成肿瘤靶向聚碳酸酯载体.再将含有叶酸基团的聚碳酸酯与5-氟尿嘧啶复合，采用高压电场喷雾法与透析法分别制备肿瘤靶向性聚碳酸酯纳米抗癌药物，并初步研究了纳米抗癌药物的体外药物控制释放性能.研究结果表明，聚碳酸酯纳米药物具有较好的药物释放性能，且高压电场喷雾法制备的纳米药物的5-氟尿嘧啶释放速率高于透析法制备的纳米药物.

致谢

感谢国家自然科学基金委员会、武汉市科技局及武汉工程大学的经费资助.

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