桥本甲状腺炎患者调节性T细胞的表达及其意义

杨治芳，吴 芳，汤佳珍，刘建英

桥本甲状腺炎(HT)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎，是最常见的自身免疫性甲状腺疾病之一，自身免疫损伤是本病导致甲状腺功能减退(甲减)的主要机制。调节性T细胞(Treg)在阻止自身免疫反应、维持免疫耐受中发挥着重要作用[1]，FOXP3是维持Treg发育和功能的关键转录因子[2]。本研究通过观察不同甲状腺功能状况HT患者外周血Treg的表达，旨在探讨HT的免疫学机制。

1　对象与方法

1.1研究对象选择2010年10月—2012年10月我院内分泌科门诊及住院部、甲状腺外科住院部HT患者46例为病例组，年龄25～60岁，平均(40.9±11.2)岁；诊断标准：血清甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)和(或)甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平明显升高，甲状腺外科手术后病理或细针穿刺涂片表现为淋巴细胞浸润；根据患者甲状腺激素水平分为甲状腺功能正常组16例，亚临床甲减组14例，临床甲减组16例。选取同期在我院体检的与病例组患者年龄、性别相匹配的健康人20例为对照组，年龄26～54岁，平均(39.4±7.5)岁。所有入选者无类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症等自身免疫性疾病，近3个月内未服用过激素类药物、免疫抑制剂等。

1.2主要试剂和仪器鼠抗人异硫氰酸荧光素(FITC)-CD4、别藻青蛋白(APC)-CD25、藻红蛋白(PE)-FOXP3及同型对照单克隆荧光抗体、细胞固定剂与打孔剂均购自美国eBioscience公司；FACS Calibur流式细胞仪为BD公司生产。CD4+T细胞磁珠分离试剂盒购自Dynal公司。磁分离架为Dynal公司生产。Trizol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自Promega公司。荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪为Bio-Rad公司生产。Sybe green定量PCR试剂盒购自Toyobo公司。

1.3方法

1.3.1外周血单个核细胞(PBMC)分离与收集获得所有入选者知情同意及医院伦理委员会批准后，抽取其外周静脉血6 ml置于肝素抗凝管，2 ml置于血常规管；肝素抗凝管于采集后2 h内分离PBMC。Hank′s缓冲液稀释外周血标本，密度梯度离心法收集PBMC，加1640完全培养基调整细胞数到2×106/ml。

1.3.2测定TregPBMC 1 ml加入5 μl FITC-CD4和5 μl APC-CD25单克隆荧光抗体，4 ℃避光20 min。磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)洗涤后，加入固定/穿膜液400 μl，室温避光40 min，PBS缓冲液洗涤后，加入缓冲液800 μl，室温避光20 min。PBS缓冲液洗涤后，加入5 μl PE-FOXP3单克隆荧光抗体或同型对照PE-IgG1，4 ℃避光20 min，PBS缓冲液洗涤后，加入固定液100 μl，于1周内进行上机检测。

1.3.3流式细胞检测采用FACS Calibur型流式细胞仪进行检测，WinMDI 2.9软件进行分析。根据前向角和侧向角圈定淋巴细胞群，设门，根据同型对照样品调整荧光检测器电压，设定阴性细胞群≥99.5%，根据独立细胞染色样品调整仪器的荧光补偿值。

1.3.4CD4+T细胞分离2 ml抗凝血中加入72 μl CD4磁珠，颠倒混匀2～3次，置低温摇床内50 r/min混匀，4 ℃孵育30 min，置于磁分离架上2～3 min，弃上清液，用PBS缓冲液或2%胎牛血清(FCS)缓冲液洗涤4～5次，重悬于1 ml Trizol，-70 ℃保存，用于提取总RNA。

1.3.5CD4+T细胞FOXP3 mRNA的表达(1)提取总RNA：按照说明书方法提取，用紫外或可见光分光光度仪检测总RNA的A260、A280浓度及A260/A280。(2)cDNA的合成：取1 μg RNA置于薄壁管，70 ℃变性10 min。依次加入10×逆转录反应缓冲液2 μl，25 mmol/L MgCl22 μl，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)2 μl，寡脱氧胸苷酸(oligo-dT)1 μl，RNA酶抑制剂(RNasin)0.5 μl，鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶0.625 μl，加入去RNA酶水使终反应体积为20 μl，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃冰浴(以上均在PCR仪完成)。所得cDNA放置于-20 ℃保存。(3)Sybe green荧光定量PCR：引物序列：FOXP3：上游5′-CAAGTTCCACAACATGCGAC-3′，下游5′-ATTGAGTGTCCGCTGCTTCT-3′，扩增长度91 bp。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)：上游5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，下游5′-GGCAACAATATCCACTTTA CCAGAGT-3′，扩增长度101 bp。反应条件：94 ℃ 20 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s。均设3个复管，以GAPDH作为内参照，FOXP3 mRNA与GAPDH mRNA比值为其相对表达量。

2　结果

2.1不同甲状腺功能状况HT患者临床特征甲状腺功能正常组、亚临床甲减组、临床甲减组患者的性别、年龄、体质指数(BMI)、TGAb、TPO-Ab水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2Treg占CD4+T细胞比例对照组Treg占CD4+T细胞比例为(4.67±1.21)%，病例组为(2.78±1.32)%，病例组Treg占CD4+T细胞比例低于对照组，差异有统计学意义(t=3.85,P<0.01)；甲状腺功能正常组、亚临床甲减组、临床甲减组Treg占CD4+T细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1　不同甲状腺功能状况HT患者临床特征比较

注：*为χ2值；BMI=体质指数，FT3=游离三碘甲状腺原氨酸，FT4=游离甲状腺素，TSH=促甲状腺激素，TGAb=甲状腺球蛋白抗体，TPO-Ab=甲状腺过氧化物酶抗体

2.3相关性分析Pearson相关分析结果显示，Treg的表达与患者年龄(r=-0.242)、TPO-Ab水平(r=-0.268)呈负相关(P<0.05)，而与患者性别(r=0.111)、BMI(r=0.004)、TGAb(r=0.149)水平无直线相关性(P>0.05)。

2.4CD4+T细胞FOXP3 mRNA的表达磁珠分离的CD4+T细胞经流式细胞仪检测鉴定，纯度达95%以上。对照组CD4+T细胞FOXP3 mRNA的相对表达量为(5.08±1.87)，病例组(抽取20例)为(3.59±0.37)，病例组CD4+T细胞FOXP3 mRNA表达水平低于对照组，差异有统计学意义(t=2.65，P<0.05)。

3　讨论

HT是器官特异性自身免疫疾病，临床表现差异较大，由于其在疾病早期无特殊临床表现，往往发展为临床甲减才被发现。临床工作中主要依据TGAb和TPO-Ab水平来判断HT患者进展为甲减的概率，但是部分患者TGAb和(或)TPO-Ab持续高水平阳性多年而甲状腺功能正常；部分患者则很快进展为甲减，需要终生甲状腺激素治疗。目前，关于不同甲状腺功能状况HT患者Treg水平变化的研究报道较少。为防止HT甲减的出现及进展，有必要进一步探讨其免疫学机制。

Treg的功能降低在自身免疫性甲状腺疾病的发生发展中起重要作用[3]。动物实验表明，Treg的数量减少和功能降低在Graves病向HT转换、出现甲减的过程中起重要作用；McLachlan等[4]研究认为，Treg可能在HT患者出现甲减中起关键作用。本研究结果显示，病例组Treg占CD4+T细胞比例及FOXP3 mRNA表达水平均明显低于对照组，存在Treg的缺陷，而不同甲状腺功能状况HT患者Treg占CD4+T细胞比例间无差异，分析其原因可能是由于HT患者的甲状腺功能状况与自身免疫活动无直接相关性，也可能与本研究样本量较小有关；同时，由于获取的细胞数有限，本研究只抽取了病例组中20例HT患者检测CD4+T细胞FOXP3 mRNA的表达，也未进行亚组分析。

Zhao等[5]研究认为HT患者Treg的表达水平随着年龄增长而下降，但两者的关系仍存在争议；Karanikas等[6]研究表明，HT患者TPO-Ab水平升高与Th1细胞因子分泌增加相关，认为TPO-Ab水平升高利于自身反应性T细胞活动增强。本研究结果显示，HT患者Treg的表达与年龄、TPO-Ab水平呈负相关，与文献报道结果基本一致。

在HT的免疫进程中还有其他CD4+辅助性T细胞的参与，CD4+T细胞亚群中的Th17细胞是诱导自身免疫的辅助性T 细胞，与Treg功能相拮抗。Th17细胞触发的免疫反应在碘诱导的HT自发性动物模型NOD-H2h4鼠发病中起着不可或缺的作用[7]。滤泡辅助性T细胞(Tfh细胞)通过细胞因子IL-6和IL-21来调节B细胞的功能，可对自身反应性B细胞产生过强的辅助信号，可能引起抗体介导的自身免疫性损伤。Tfh细胞调节异常时，非淋巴组织产生大量的IL-21，可激发广泛效应，导致自身免疫性炎症。新近研究表明，自身免疫性甲状腺炎患者外周血中Tfh细胞比例明显升高，且HT患者甲状腺内可检测到Tfh细胞，甲状腺内IL-21和Bcl6 mRNA表达水平升高[8]。因此，如能在今后的研究中进一步扩大样本量，加入Th17细胞和Tfh细胞作为检测项目，将有助于进一步了解HT的免疫学机制。

1Goodman WA，Cooper KD，McCormick TS.Regulation generation：the suppressive functions of human regulatory T cells[J].Crit Rev Immunol，2012，32(1)：65-79.

2Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY，et al.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003，4(4)：330-336.

3Nakano A，Watanabe M，Iida T，et al.Apoptosis-induced decrease of intrathyroidal CD4+CD25+regulatory T cells in autoimmune thyroid diseases[J].Thyroid，2007，17(1)：25-31.

4McLachlan SM，Nagayama Y，Pichurin PN，et al.The link between Graves′disease and Hashimoto′s thyroiditis：a role for regulatory T cells[J].Endocrinology，2007，148(12)：5724-5733.

5Zhao L,Sun L,Wang H,et al.Changes of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in aged Balb/c mice[J].J Leukoc Biol,2007,81(6):1386-1394.

6Karanikas G,Schuetz M,Wahl K,et al.Relation of anti-TPO autoantibody titre and T-lymphocyte cytokine production patterns in Hashimoto′s thyroiditis[J].Clin Endocrinol(Oxf),2005,63(2):191-196.

7Horie I，Abiru N，Nagayama Y，et al.T helper type 17 immune response plays an indispensable role for development of iodine-induced autoimmune thyroiditis in nonobese diabetic-H2h4 mice[J].Endocrinology，2009，150(11)：5135-5142.

8Zhu C，Ma J，Liu Y，et al.Increased frequency of follicular helper T cells in patients with autoimmune thyroid disease[J].J Clin Endocrinol Metab，2012，97(3)：943-950.