血清miR-200c水平对胃癌的诊断价值

林国友 钟海兵 张雪燕 彭永剑

血清miR-200c水平对胃癌的诊断价值

林国友 钟海兵 张雪燕 彭永剑

目的探讨静脉血清miR-200c水平对胃癌的诊断价值。方法采用逆转录荧光PCR方法检测50例胃癌患者和50例健康对照者静脉血清中miR-200c的表达，统计分析miR-200c与临床病理参数之间的关系。结果胃癌患者中血清miR-200c水平明显高于健康对照组；ROC曲线分析显示，miR-200c诊断胃癌的ROC曲线下面积为0．725（95%CI 0．698～0．851）,敏感度和特异度分别为67．5%和78．5%。miR-200c水平与患者年龄、性别、肿瘤大小和TNM分期无关。结论血清miR-200c水平可能成为胃癌独立诊断标志物。

胃癌 miR-200c 诊断价值

【 Abstract】 ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of serum miR-200c as a tumor biomarker in patients with gastric cancer．MethodsFifty patients with gastric cancer and 50 healthy controls were enrolled in the study．Total RNA was extracted from serum samples for measurement of miR-200c levels using real-time PCR．The relationship between miR-200c levels and clinical characteristics of gastric cancer patients was analyzed．ResultsThe relative abundance of serum miR-200c was significantly higher in gastric cancer group than that in control group(P＜0．05)．The AUC-ROC for diagnosing gastric cancer was 0．725 (95%CI 0．698～0．851),and the sensitivity and specificity was 67．5%and 78．5%separately．The circulating miR-200c level was not correlated with the sex,age,tumor volume and TNM stage．ConclusionThese data suggest that increased miR-200c levels are detected in the blood of gastric cancer patients and circulating miR-200c may be used as biomarker for gastric cancer．

胃癌作为常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和病死率均居恶性肿瘤前列，早期诊断对提高胃癌患者生存率，改善生活质量有着极其重要的意义[1]。近年来发现miRNAs是一群生物体内产生的内源性的非编码单链小分子RNA，广泛参与各种肿瘤的发生、发展，具有肿瘤早期诊断标志物的价值[2]。miR-200家族包含miR-200a、miR-200b、miR-429、miR-200c和miR-141[3]。我们通过实时荧光定量PCR技术在胃癌患者血清中检测miR-200c的表达，探讨miR-200c在胃癌诊断中的作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2010-01—2012-12就诊于温岭市第四人民医院的50例新发胃癌患者的静脉血清标本（胃癌组），男36例，女14例，年龄36～78（62.76±11.35）岁。所有胃癌患者术前均未进行放疗、化疗及其它针对肿瘤的治疗。另收集该院同期50例健康体检者的静脉血清标本作为健康对照组，男37例，女13例，年龄35～75（63.02±9.97）岁。两组性别、年龄比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血清留取及RNA的提取 血液离体2h血清自然析出后2 000r/min离心15min，吸取上层血清保存于-80℃冰箱备用。采用Trizol-LS（美国Invitrogen公司产品）试剂提取血清总RNA，取血清1ml与3ml Trizol-LS充分混匀后，严格按照试剂说明书进行操作。

1.2.2 miR-200c定量检测 miR-200c定量检测采用茎环逆转录荧光定量PCR方法，以U6为内参，引物与探针购自美国Applied biosystems公司。逆转录反应体系如下：10×逆转录缓冲液1.5μl，100mM dNTP 0.15μl，逆转录酶1.0μl，RNase抑制剂0.19μl，逆转录引物3.0μl，总RNA5.0μl，水补足15μl后，置30℃孵育30min，42℃孵育45min，85℃孵育5min。荧光PCR体系如下：2×PCR缓冲液10μl，20×miR-200c特异引物和荧光探针 1μl，逆转录产物 1μl，水补足至 20μl，置ABI7500荧光PCR仪上按照95℃5min，95℃15s，60℃45s反应40个循环，采集数据分析结果。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验；血清miR-200c水平对胃癌的诊断价值采用logistic回归分析及ROC曲线下面积进行评价；血清miR-200c水平与临床病理参数关系的分析采用χ2检验。

2 结果

2.1 两组血清总RNA含量的比较 1ml血清提取的总RNA含量在胃癌组为（41.21±6.15）ng/μl，健康对照组为（39.69±9.84）ng/μl，两组间无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 两组血清miR-200c水平的比较 以U6做内参计算血清miR-200c的相对含量，结果显示胃癌组血清miR-200c水平明显高于健康对照组（P＜0.05），见图1。

图1 两组血清miR-200c水平的比较（以U6为内参的相对值，*有1个样本水平超过0.5）

2.3 血清miR-200c水平与患者临床病理参数关系分析 将血清miR-200c相对表达水平临界阈值设定为0.12（miR-200c相对表达水平在0.12以上诊断为胃癌），对其与患者临床病理参数的关系进行分析，结果表明血清miR-200c水平与患者年龄、性别、肿瘤大小和TNM分期等因素无关（表1），说明血清miR-200c水平是胃癌的一个独立诊断指标。

2.4 血清miR-200c水平对胃癌的诊断分析 ROC分析结果显示ROC曲线下面积为0.725（95%CI 0.698～0.851），见图2。根据ROC分析，将miR-200c相对表达水平临界阈值设定为0.12时，诊断敏感度为67.5%，特异度为78.5%。

3 讨论

肿瘤标志物是指在恶性肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或由机体对肿瘤反应而异常产生或升高的反映肿瘤存在和生长的一类物质，存在于患者的血液、体液、细胞或组织中，传统观点认为此类肿瘤标志物可以反映癌细胞的存在与活跃程度。

表1 血清miR-200c水平与临床病理参数的关系（例）

图2 血清miR-200c水平诊断胃癌的ROC曲线

以往各种纷繁复杂的肿瘤标志物多集中于蛋白质水平，而且临床工作中以及大量的研究结果显示以上的肿瘤标志物存在一定的局限性[4-6]。miRNA在多种生理和病理过程中发挥作用，如细胞周期、细胞凋亡、细胞分化调控、伤口愈合和免疫系统等。miRNA的表达谱具有组织特异性，在一些疾病尤其是肿瘤组织中miRNA表达明显改变，可用于肿瘤等疾病的诊断和预后。最近在人血清等体液中检测到稳定性良好的循环miRNA，在正常人和肿瘤等疾病患者体内循环miRNA的表达谱存在明显的差异，因此循环miRNA很可能成为肿瘤等疾病的非侵入性的、准确的新型生物标志物[7-8]。miRNA标志物将成为疾病发生、发展相关基因标志物、蛋白质标志物和代谢物标志物整体网络中的结点。

本研究通过荧光PCR技术检测了miR-200c在胃癌患者血清中的含量，确定了其在胃癌患者中高表达；而且与年龄、性别等因素无关，可能是一个独立诊断指标；随着研究的深入，在血浆miRNA中可能会发现更为理想的胃癌标志物，从而有助于提高胃癌的诊断水平，改善胃癌的治疗效果及预后。

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Serum miR-200c in diagnosis of gastric cancer

Gastric cancermiR-200c Diagnostic value

2013-01-18）

（本文编辑：沈昱平）

温岭市科学技术局资助项目(2012-12-95)

317511 温岭市第四人民医院消化内科（林国友、彭永剑）；温岭市第一人民医院（钟海兵、张雪燕）

林国友,E-mail：wllinguoyou@163.com