Sirt1在非小细胞肺癌中的表达及临床病理学意义

2013-04-19彭芳赵力王国付林爽燕

浙江医学 2013年10期

彭芳赵力王国付林爽燕

彭芳赵力王国付林爽燕

目的探讨非小细胞肺癌组织中Sirt1的表达及其对患者预后的影响。方法收集264例非小细胞肺癌手术治疗患者的临床病理资料和术后生存随访资料，通过免疫组化的方法检测Sirt1的表达，分析其与患者临床病理指标及预后之间的关系。结果Sirt1在非小细胞肺癌组织中明显高于周围正常肺组织，差异具有统计学意义（P＜0．05），并且在肿瘤组织（尤其是鳞状细胞癌）中Sirt1表达越高，患者预后越差。而与年龄、性别、肿瘤组织学类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移、临床TNM分期等无明显关系（均P＞0．05）。结论Sirt1在非小细胞肺癌（尤其鳞癌）组织中的表达水平有望成为预测非小细胞肺癌患者预后的生物标志物。

非小细胞肺癌 Sirt1 临床病理因素预后

沉默信息调节因子2（Sir2）相关酶1（Sirt1）是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的去乙酰化酶。它以许多非组蛋白和组蛋白为底物，与多种细胞生物学功能如基因转录沉默、细胞生长周期调节、能量代谢、胰岛素分泌、血管生成、神经保护、病毒感染以及细胞衰老密切相关。近年来研究显示，Sirt1在许多人类恶性肿瘤中表达上调，提示其可能参与了肿瘤的形成及进展过程。Sirt1在肿瘤形成中究竟如何发挥作用成为研究者关注的热点。本研究以免疫组化染色方法，检测Sirt1在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达情况，分析Sirt1表达与临床病理学参数以及预后间的关系，探讨Sirt1在非小细胞肺癌发生、发展中可能起到的作用，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料收集浙江医院病理科2002-01—2010-12非小细胞肺癌存档标本264例为观察组（患者均为首次发现肺癌，术前未经任何治疗）。其中男191例，女73例；年龄35～84（63.3±10.3）岁，其中＞60岁160例，≤60岁104例；肿瘤按WHO肺癌组织分类方法分类，其中鳞癌137例，腺癌127例；高分化62例，中分化124例，低分化78例；无淋巴结转移106例，淋巴结转移158例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为100、97、37、30例。在264例非小细胞肺癌中选择101例，取距肿瘤3cm以上的正常肺组织为对照组。所有标本经10%中性甲醛固定，常规处理后石蜡包埋。对所有患者进行随访，其中失访46例（17.42%）。

1.2 检测试剂兔抗人单克隆抗体Sirt1（克隆号：E104）购自英国abcam公司，EnVision试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山公司。

1.3 检测方法检测Sirt1采用免疫组化EnVision法。操作步骤依照EnVision试剂盒说明书进行免疫组化染色。石蜡块常规制备4μm厚切片，常规脱蜡、水化，柠檬酸高压抗原修复，滴加一抗后4℃过夜，滴加二抗后DAB显色，苏木素复染，染色中采用PBS代替一抗作为阴性对照，乳腺癌肿瘤组织作为阳性对照。

1.4 结果判断肺癌的组织学分类按照2004版WHO肺癌组织学分类，TNM分期按照国际肺癌研究协会（IASLC）2009年第7版分期标准。免疫组化结果评定：Sirt1在无背景着色情况下以胞核出现黄色或棕色颗粒者为阳性表达，阳性评分由2位病理科医师读片并判断。0分为染色细胞比例为肿瘤组织的0～5%，1分为6%～35%，2分为36%～70%，3分为71%～100%。

1.5 统计学处理采用SPSS19.0统计软件，Sirt1在非小细胞肺癌和正常肺组织中的表达用配对卡方McNemar检验法，Sirt1与各临床病理因素的分析采用χ2检验。生存分析的作图采用Kaplan-Meier生存曲线。影响生存期的相关因素分析采用Cox多因素回归分析法。

2 结果

2.1 Sirt1在非小细胞肺癌和正常肺组织中的表达对101例非小细胞肺癌组织和正常组织的配对研究结果显示，非小细胞肺癌组织和正常组织的Sirt1表达均阳性5例，均阴性39例，肿瘤组阳性而对照组阴性者56例，肿瘤组阴性而对照组阳性者1例，差异有统计学意义（χ2=53.07，P＜0.01）。

2.2 Sirt1在肺癌中表达与肺癌临床病理特征的关系见图1、2和表1。

图1 Sirt1在肺癌组织中的表达（EnVision法，×100）

图2 Sirt1在肺癌组织中的表达（EnVision法，×400）

由图1、2可见，Sirt1在肺癌组织中呈强阳性表达，阳性着色定位于肺癌组织的细胞核，呈棕黄色。

由表1可见，Sirt1表达在不同的患者年龄、性别、肿瘤组织学类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移及肿瘤分期之间的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 非小细胞肺癌组织中Sirt1的表达与临床病理特征的关系

2.3 Sirt1的表达对非小细胞肺癌患者预后的影响 Sirt1在肺癌中表达的Kaplan-Meier生存曲线见图3。

图3 Sirt1在非小细胞肺癌中表达的Kaplan-Meier生存曲线

由图3可见，非小细胞肺癌Sirt1阴性组（0分）平均生存时间长于阳性1～3分组（均P＜0.01），而1～3分间生存时间比较均无统计学意义（均P＞0.05）。表示非小细胞肺癌Sirt1表达阳性预示预后较差，而不同的表达强度与预后无明显相关。

2.4 Sirt1在137例肺鳞癌和127例腺癌中表达的Kaplan-Meier生存曲线分别见图4、5。 t 1

图4 Sirt1在肺鳞癌中表达的Kaplan-Meier生存曲线

图5 Sirt1在肺腺癌中表达的Kaplan-Meier生存曲线

由图4可见，肺鳞状细胞癌Sirt1阴性组（0分）平均生存时间长于阳性1～3分组（均P＜0.01），而1～3分间生存时间比较均无统计学意义（均P＞0.05）。表示肺鳞癌Sirt1表达阳性预示预后较差，而不同的表达强度与预后无明显相关。

由图5可见，肺腺癌Sirt1阴性组（0分）与阳性1～3分组无明显区别（均P＞0.05）。表示肺腺癌中Sirt1表达阳性及强度与预后无明显相关。

2.5 影响生存期的相关因素分析年龄（χ2=60.858，P＜0.01）、分化程度（χ2=89.499，P＜0.01）、TNM分期T（χ2=438.79，P＜0.01），淋巴结（χ2=111.339，P＜0.01），Sirt1（χ2=42.067，P＜0.01）是非小细胞肺癌患者长期生存的独立影响因素。由于年龄、TNM分期、Sirt1的回归系数（B）均为正值，而分化程度的回归系数为负值，提示年龄增加、低分化、肿瘤原发灶越大（T）、淋巴结转移越多（N）、有远处转移、高Sirt1分级是死亡的危险因素；其中，年龄每增加一个级别，死亡风险增加1.018倍；分化程度每降低一个级别，死亡风险增加0.759倍；原发灶大小每增加一个级别，死亡风险增加1.701倍；淋巴结转移数量每增加一个级别，死亡风险增加1.355倍；有远处转移是无远处转移的1.264倍；Sirt1每增加一个级别，死亡风险增加1.142倍。

3 讨论

衰老和肿瘤都是蓄积性细胞损失的结果，并且都与在损失应答中特定基因的调节有关。肿瘤是一种年龄相关性疾病，肿瘤细胞恶性增殖主要表现在两个方面：凋亡障碍和增殖失控。Sirt1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的去乙酰化酶,人Sirt1编码基因位于染色体10q22.1，约33kb，分子质量为60KD。在体内通过与不同的非组蛋白和组蛋白相互作用来完成不同的功能，在生长调节、应激应答、肿瘤形成和内分泌信号上有着广泛的生物学功能，并可以影响与肿瘤细胞凋亡及增殖密切相关的多种蛋白的活性[1]，使突变的肿瘤细胞逃避凋亡和衰老抑制，导致肿瘤和其它疾病的发生。已经证实Sirt1通过对p53蛋白C末端第283位赖氨酸残基的去乙酰化抑制p53作为转录激活因子的活性，减少P53途径的细胞凋亡和生长抑制，延长寿命，促进肿瘤发生[2-3]。其它与Sirt1相互作用的蛋白因子还有很多，如超甲基化癌蛋白HIC1通过与Sirt1形成蛋白复合物，结合在Sirt1基因的启动子上抑制其表达，当HIC1蛋白缺失或失活后，Sirt1表达增强，促进肿瘤发展。AROS蛋白、E2F1可以增强Sirt1的活性[4]。VDR能选择性调节Sirt1的功能[5]。DBC1负向调节Sirt1的功能[6]。这些蛋白能在转录中、转录后、翻译及修饰等多处水平对Sirt1的表达及活性功能进行调控。

本研究结果提示，与癌旁正常组织中Sirt1水平相比，非小细胞肺癌组织中Sirt1表达明显增强，虽然其表达与各项临床病理参数均无明显相关性，但Cox多因素回归分析表明Sirt1阳性程度每增加一个级别，患者死亡风险增加1.142倍，Sirt1是非小细胞肺癌患者长期生存的独立影响因素。

本研究中Sirt1阳性者生存期明显缩短（P＜0.01），这与Tseng等[7]的报道一致（Sirt1阳性者平均生存时间为25.9个月，而阴性者平均生存时间为43.5个月，P＜0.01）。并且本研究在亚型分析中显示与预后的相关性主要体现在肺鳞癌中，而腺癌没有明显关系，这可能与将肿瘤分鳞癌、腺癌两组统计后样本数偏小所致。虽然Tseng[7]没有分别统计鳞癌与腺癌与生存期的相关性，但其研究中也表明肺鳞癌患者Sirt1表达增强更明显，预后更差，因而认为Sirt1-p53通路在非小细胞肺癌尤其是肺鳞癌的发生、发展中起着重要作用，并且对鳞癌和腺癌的调节机制很可能是不同的。我们在后续试验中要扩大样本量，期望得到更多完整数据，对生存期进行更科学的统计。

在既往研究中，Jung-Hynes等[8-9]报道与人类正常前列腺上皮组织相比，前列腺癌的细胞中Sirt1明显有高表达（8～13倍）。抑制Sirt1可阻止FoxO的活性，可在不影响正常前列腺上皮细胞的前提下抑制前列腺癌的发展。但相反Powell[10]等的研究却表明Sirt1可抑制前列腺上皮细胞的增殖活性。Sirt1的缺失可诱导前列腺上皮内瘤变的发生，表明了Sirt1的抗肿瘤作用。Kabra[11]的报道Sirt1在正常肠黏膜上皮及良性腺瘤中高表达，相反结肠腺癌肿瘤组织中低表达，同样表明了Sirt1具有抑制肿瘤生长发展的作用。从目前的报道看，Sirt1在乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌中呈现高表达，在卵巢癌、膀胱癌中呈现低表达，因此Sirt1到底在肿瘤中起着促进发生还是抑制发展，有可能是在不同的恶性肿瘤中有不同的作用机制，并且其表达含量及蛋白活性不同，同时Sirt1的底物众多，其具体机制还需要人们更深入的研究。

Wang等[12]发现Sirt1的高表达可能抑制Brca1突变相关的细胞生长和肿瘤的形成。因此有望利用此来治疗Brca1相关的乳腺癌患者。已有报道抑制Sirt1可以抑制癌细胞的生长并增强放疗的抗癌作用[13]。Suzuki等[14]报道Sirt1的激活剂SRT1720可以促进乳腺癌的肺转移，因此Sirt1有潜力成为抑制肿瘤转移的靶向目标。这也与Van等[15]综述中讨论的一致，通过使用化学药物或蛋白调节对Sirt1的活动加以抑制，可以抑制肿瘤的生长，但还需要对Sirt1在正常及不同肿瘤中的作用机制进一步研究，并需要经过临床试验的认证。

综上所述，本研究提示非小细胞肺癌尤其是鳞癌组织中Sirt1的表达水平可能是判断患者预后的重要标志物。但调节其蛋白水平和活性的分子机制，以及影响非小细胞肺癌预后的具体机制有待进一步研究。而针对Sirt1的表达及活性进行干预的相关药物，有希望成为预防和治疗癌症的靶向药物。

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Expression of Sirt1 in non-small-cell lung cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of Sirt1 in non-small-cell lung cancer(NSCLC)and its clinicopathological significance．MethodsThe clinicopathological data of 225 patients with NSCLC admitted in Zhejiang Hospital from 2002 to 2010 were retrospectively reviewed．Immunohistochemistry was used to examine the expression of Sirt1 in specimens of lung cancer and pericancerous tissue．The correlations of Sirt1 expression with clinicopathological features and survival of patients were analyzed．ResultsThe expression of Sirt1 was significantly higher in cancerous tissues than that in adjacent noncancerous tissues．The expression of Sirt1 was significantly correlated with overall survival of patients,particularly in patients with squamous cell carcinoma;however,it was not correlated with the age,gender of patients and the histological classification,differentiation, tumor size,lymph node metastasis,distant metastasis and TNM stage of the cancer．ConclusionSirt1 might be a novel biomarker for prognosis of patients with non-small cell lung cancer．

Non-small cell lung cancer Sirt1 Clinicopathological characteristics Prognosis