自噬相关蛋白Beclin1、MAPLC3在胃癌中的表达及临床意义

2013-04-18杨勇明崔健丁丽君王建江阮华娟方亚平

浙江医学 2013年23期

杨勇明崔健丁丽君王建江阮华娟方亚平

杨勇明崔健丁丽君王建江阮华娟方亚平

目的探讨胃癌组织中自噬相关蛋白Beclin1与微管相关蛋白轻链3（MAPLC3）的表达及其临床意义。方法采用免疫组化En-Vision法检测59例胃癌组织和相应的癌旁组织中Beclin1及MAPLC3的表达水平，分析其与多种胃癌临床病理参数之间的关系。结果在胃癌组织中Beclin1和MAPLC3的阳性表达率分别为40.7%和44.1%,癌旁组织的阳性表达率分别为100%、93.2%，癌组织明显低于癌旁组织（P＜0.05）；Beclin1和MAPLC3的表达水平与胃癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期相关（P＜0.05）；胃癌组织中Beclin1和MAPLC3的表达水平呈正相关（r=0.425，P＜0.05）。结论胃癌组织中Beclin1和MAPLC3表达水平均明显低于癌旁组织，且两者之间呈正相关，两者的低表达可能共同促进胃癌的淋巴结转移。

胃肿瘤 Beclin1基因 MAPLC3基因

自噬性细胞死亡是一种不同与凋亡、不依赖Caspase的程序性细胞死亡，自噬的抑制与肿瘤的发生有关，已经成为目前探讨肿瘤发生和抑制肿瘤生长、克服肿瘤化疗耐药性研究的新热点。自噬基因Beclin1是一个双等位肿瘤抑制基因。研究表明[1]，Beclin1下调明显增加肝癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌的发生率。MAPLC3是哺乳动物细胞中酵母ATG8基因的同源物，定位在自噬体膜上，参与自噬体的形成，特异地反映细胞内自噬体的数量，现已作为自噬体的特异性标记蛋白。目前国内外有关Beclin1及MAPLC3的表达对胃肠道肿瘤影响的研究鲜有报道，也未见有关Beclin1和 MAPLC3表达水平的相互关系及其与胃癌淋巴结转移关系的相关研究报道。本研究采用免疫组化法染色，探讨Beclin1和MAPLC3的表达在胃癌淋巴结转移过程中的作用和可能机制及其临床意义，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料收集本院2008-01—2012-12资料完整、手术切除的胃癌组织及相应癌旁组织（距离癌组织5cm以上，经HE染色证实均无癌组织）标本各59例，术后均经病理HE染色证实诊断。患者中男36例,女23例；年龄32～72岁,中位年龄55.3岁。肿瘤位于胃底-贲门10例，胃体15例，胃窦34例；肿瘤＜5cm 49例，≥5cm 10例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期37例；高、中分化33例，低、未分化26例。患者术前均未进行化、放疗。

1.2 方法 Beclin1鼠抗人单克隆抗体和免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用免疫组化En-Vision法。标本经10%甲醛固定、石蜡包埋后4μm厚连续切片后进行染色。染色步骤按试剂盒要求进行。采用双盲法随机选取10个高倍视野（×400），每个高倍视野计数100个肿瘤细胞。观察阳性细胞所占的百分数及染色强度。对阳性细胞所占的百分数计分，以百分数＜5%=0、5%～25%=1、26%～50%=2、51%～75%= 3、＞75=4。同时以染色强度无色=0、淡黄色=1、棕黄色= 2、深棕色=3进行评分。最后累积积分＞3分为阳性表达，否则视为阴性表达。

1.3 统计学处理采用SPSS15.0统计软件。计数资料采用χ2检验，等级相关分析采用Spearman检验。

2 结果

2.1 Beclin1和MAPLC3在胃癌组织中的表达 Beclin1主要表达于细胞质，少量或微量表达于细胞膜，MAPLC3主要表达于细胞质。59例胃癌组织标本中Beclin1阳性表达率显著低于癌旁组织，差异有统计学意义（χ2=38.89，P＜0.01）。胃癌组织中MAPLC3阳性表达率显著低于癌旁组织，差异有统计学意义（χ2=30.12，P＜0.01），详见表1。

表1 Beclin1和MAPLC3在胃组织中的表达[例(%)]

2.2 胃癌组织标本Beclin1和MAPLC3的表达水平与临床病理参数之间的关系胃癌组织中Beclin1和MAPLC3的表达水平与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度无关（均P＞0.05）；而与淋巴结转移、浸润深度、TNM分期有关（均P＜0.05），详见表2、3。

2.3 Beclin1与MAPLC3两者表达水平之间的关系Beclin1阳性表达组中MAPLC3阳性表达率为75.0%（18/ 24），Beclin1阴性表达组中MAPLC3阳性表达率为45.7%（16/35），差异有统计学意义（P＜0.05）。Spearman等级相关分析表明两者之间呈正相关（r=0.425，P＜0.05）。

3 讨论

自噬是一个发生在真核细胞中由细胞初级溶酶体处理内源性底物的重要生理过程，生命体借此维持蛋白代谢平衡及细胞内环境的稳定。它既广泛存在于正常的生理过程中，如细胞废物清除、结构重建、生长分化等，又是细胞对不良环境的一种防御机制，如对抗营养缺乏、电离辐射，同时还参与多种疾病的病理过程。

表2 胃癌组织中Beclin1的表达与胃癌临床病理特征的关系（例）

Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因，位于人类染色体17q21上，大约有150ku[2]。Beclin1基因主要通过与ⅢP13K形成复合体来调节其它的ATG蛋白在自噬前体结构中定位，调节自噬活性[3]。Beclin1是抑癌基因之一，与肿瘤发生、发展有关。据报道，40%～75%的人类偶发性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌细胞中Beclin1存在单等位基因缺失突变[4]；Beclin1等位基因敲除的小鼠自发性恶变概率增加，且易受HBV诱导的前恶变性损伤[5]。Beclin1已被认为在调节自噬活性参与肿瘤发生、发展中起重要作用。国内李捷等[6]通过免疫组织芯片、免疫组织化学和Westernblot法检测胃癌及相应癌旁组织发现癌组织Beclin1低表达（P＜0.05）。本实验结果显示：在59例胃癌组织标本中Beclin1的阳性表达率为40.7%,癌旁组织的阳性表达率为100%，癌组织明显低于癌旁组织（P＜0.05），提示Beclin1可能参与了胃癌的发生，也是胃癌发生的一个早期事件之一。本研究还发现：Beclin1的低表达与胃癌的临床病理分期、淋巴结转移、浸润深度有密切关系（P＜0.05），而与患者的年龄、性别、肿瘤的大小、部位、肿瘤细胞的分化程度无明显相关（P＞0.05）。在分期较晚、伴有淋巴结转移、侵及浆膜及浆膜外的胃癌组织中，Beclin1的表达率显著降低。上述结果提示，Beclin1在胃癌的发生、发展及浸润、转移过程中起着重要的作用。

表3 胃癌组织中MAPLC3的表达与胃癌临床病理特征的关系（例）

MAPLC3是哺乳动物细胞中酵母 ATG8（Aut7/ Ap98）基因的同源物，定位予前自噬泡膜表面，参与自噬体的形成。MAPLC3有Ⅰ型、Ⅱ型之分。未发生自噬时，细胞内合成的MAPLC3经过加工，成为胞质可溶性的I型MAPLC3，常规表达。当自体吞噬发生时，Ⅰ型MAPLC3经泛素样加工修饰过程，与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）结合，形成Ⅱ型MAPLC3。MAPLC3结合并始终位于胞内自噬体的膜上，其含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。因此，MAPLC3的表达强度与自噬活性密切相关，现已作为自噬体的特异性标记蛋白[7]。

对于自噬在不同器官肿瘤，或者同一器官不同类别肿瘤，甚至同一肿瘤的不同发展阶段的表达情况，目前报道结果不一。国外Othman等[8]通过免疫组织化学检测67例乳腺癌组织发现人类LC3两个亚型LC3A和LC3B在乳腺癌组织中的表达有所差异，其中LC3A在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于LC3B，并认为LC3A可能在乳腺癌发生、发展中扮演更重要的角色。国内吴妍等[9]采用免疫组织化学和RT-PCR技术检测40例乳腺浸润性癌和10例乳腺非浸润性癌时，也验证了正常乳腺组织乳腺增生性病变乳腺非浸润性癌和浸润性癌4组患者中LC3A和LC3B均有不同程度的高表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；且在乳腺癌Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中LC3A表达依次呈递增趋势，也认为LC3A可能在乳腺癌的发生、发展过程中起着重要作用。本实验结果显示：在59例胃癌组织标本中MAPLC3的阳性表达率为44.1%,癌旁组织的阳性表达率分别为93.2%，癌组织明显低于癌旁组织（P＜0.05）。MAPLC3的低表达与胃癌的临床病理分期、淋巴结转移、浸润深度有密切关系（P＜0.05），而与患者的年龄、性别、肿瘤的大小、部位、肿瘤细胞的分化程度无明显相关(P＞0.05)。在分期较晚、伴有淋巴结转移、侵及浆膜及浆膜外的胃癌组织中，MAPLC3的表达率显著降低。由于淋巴结转移是影响预后的独立因素，因此MAPLC3的低表达常提示预后较差，并可能与胃癌的浸润、转移有关。

本研究结果显示，Beclin1阳性表达组中MAPLC3阳性表达率为75.0%（18/24），Beclin1阴性表达组中MAPLC3阳性表达率为45.7%（16/35），差异有统计学意义（P＜0.05）。Spearman等级相关分析表明两者之间呈正相关（P＜0.05），提示两者在胃癌淋巴结转移中起协同作用，可能在它们的共同低表达作用下，癌细胞的侵袭力及向淋巴管的渗透能力增强，使得癌细胞更容易转移至局部淋巴结并形成转移灶。因此，研究调节Beclin1、MAPLC3的表达将有可能为胃癌的预防和治疗开辟新的途径。

[1]王霞,郭娜,弥曼,等.Beclinl与肿瘤研究进展[J].现代肿瘤医学,2013, 21(5):1149-1151.

[2]Friedman L S.The search for BRACA1[J].Cancer Res,1994,54 (24):6374-6382.

[3]Edinger A L,Thompson C B.Defective autophagy leads to cancer [J].Cancer Cell,2003,4(6):422-426.

[4]Cuervo A M,Dice J F.A receptor for the selective uptake and degradation of proteins by lysosomes[J].Science,1996,273 (5274):501-504.

[5]Q U X,Y U J,Bhagat G,et al.Promotion of tumorgenesis by het-erozygous disruption ofthe beclin 1 autopahgy gene[J].J Clin Invest,2003,112(12):1809-1820.

[6] 李捷,于观贞,王杰军,等.Beclin1和PTEN蛋白在胃癌中的表达及预后价值[J].中华消化杂志,2012,32(3):170-174.

[7]Mizushima N,Yoshimofi T,Ohsumi Y.Role of the pagel2 conjugation system in mammalian autoghagy[J].Int J Biochem Cell Biod, 2003,35(7):553-561.

[8]Othman E Q,Kaur G,Mutee A F.Immunohistochemical expression of MAP1LC3A and MAP1LC3B protein in breast carcinoma tissues[J].Journal of Clinical Laboratory Analysis,2009,23(4): 249-258.

[9]吴妍,范钦和.乳腺癌中微管相关蛋白LC3A和LC3B的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(6):615-619.

Expression of Beclin1 and MAPLC3 in the tissue of gastric cancer and its significance

Objective To investigate the expression of Beclin1 and MAPLC3 in gastric cancer and clinical significance. Methods Immunohistochemical assay was performed to detect the expression of Beclin1 and MAPLC3 in fifty-nine gastric carcinoma tissues and their adjacent noncancerous specimens.Results (1)The expression of Beclin1 and MAPLC3 was both decreased in carcinoma tissues(24/59,40.7%and 26/59,44.1%),which were significantly lower than those in noncancerous tissues (P＜0.05).(2)The expression of both Beclin1 and MAPLC3 was correlated with depth of invasion,lymph node metastasis and TNM classification(P＜0.05).(3)There was positive correlation between the expression of Beclin1 and MAPLC3(r=0.425,P＜0.05). Conclusion The expression of Beclin1 and MAPLC3 both reduced in gastric carcinoma tissues,and the downregulation of Beclin1 is significantly associated with MAPLC3.The co-downregulation of Beclin1 and MAPLC3 may play an important role in lymphatic spread of gastric carcinoma.

Gastric cancerBeclin1 MAPLC3