制备型液相色谱法及其在制药和天然产物分离中的应用

李洪彬 周建民 刘 艳

0 引言

色谱法分离是20世纪60年代诞生的一种高效分离纯化技术。其利用组分在固定相和流动相中的分配系数的微小差异，当两相作相对运动时，不同组分将形成不同迁移速度的谱带，使组分彼此分离，从而达到分离的目的。

制备型高效液相色谱（preparative high performance liquid chromatography，Prep-HPLC）是一种使用高压、恒流输液泵系统在高分辨率、大直经、高载量分离柱上进行样品高纯度分离的液相色谱制备方法。该方法分离的产品在纯度、回收率、分离效果等方面远远优于传统的制备方法，因此在制药、天然产物的分离领域中得到了广泛的应用。对于那些用常规方法难以分离的产物、热敏性物系以及具有生物活性物系的分离，色谱法具有独特的优越性。本文就近年来Prep-HPLC方法的研究进展及其在制药和天然产物分离中的应用作一综述。

1 制备型高效液相色谱概述

1.1 Prep-HPLC的工作原理及特点

Prep-HPLC的原理是基于20世纪60年代诞生的色谱法分离，其利用组分在固定相和流动相中的分配系数的微小差异，当两相作相对运动时，不同组分将形成不同迁移速度的谱带，使组分彼此分离，从而达到分离的目的。与其他分离手段相比，Prep-HPLC具有以下特点：

（1）采用高柱效色谱柱，分离效率高；

（2）可以根据工艺需要自行装柱，采用动态轴向压缩柱装柱，操作简单，装填的柱效高；

（3）应用范围广，对极性和非极性、离子型和非离子型、小分子和大分子、热稳定性和热不稳定性化合物均具有较好的分离效果；

（4）根据分离化合物的性质可配备不同类型的检测器，如紫外检测器（UV）、蒸发光散射检测器（ELSD）、二极管阵列检测器（DAD）；

（5）可进行工业级大量生产，进样量大，可连续进样、生产，完成克级至千克级样品的分离。

1.2 Prep-HPLC和分析型HPLC的区别

HPLC按照操作方式和目的的不同可分为分析型和制备型2类。分析型是以分离、鉴别及鉴定为目的，不需要对样品进行回收；Prep-HPLC是从混合物中分离得到纯化合物，是一个纯化过程，上样量大，通常需要特定的装置和一定的操作条件。

1.3 Prep-HPLC的分类

Prep-HPLC根据待分离样品的量可分为2类，一类为实验室规模制备，另一类为工业生产型规模制备。实验室规模制备属于做研发阶段的小试或中试实验，但也有因为需要的样品量很少而采取实验室规模制备的，样品量为毫克级，分离的样品一般进行生物活性测定、结构鉴定，以及作为标准品等。这类色谱分离中，经济效益并不是首要考虑的问题，其对设备精度要求比较高，要达到一定的精度要求，方可进行实验。对于工业生产型制备高效液相色谱，经济效益是其整个纯化过程考虑的核心因素，纯化样品量为克级至千克级。这类色谱要求达到预期的分离目的，必要时候还要求对溶剂回收利用，避免污染环境。

1.4 影响Prep-HPLC分离的因素

影响Prep-HPLC分离纯化的因素有很多，包括色谱柱的柱径、柱长、填料尺寸、上样量以及流动相的组成、流速等。

1.4.1 色谱柱尺寸的影响

王志祥等考察了柱子尺寸对柱效和分离度的影响，认为增加柱子长度可以提高分离效果，但相应柱压也会增大。为了提高制备量，可以使用内径较大的制备柱，但随着色谱柱直径的增大，会产生柱放大效应，使得柱效降低，导致总分离效果下降。

Koh和Guiochon等在动态轴向压缩条件下研究了色谱柱长度对Prep-HPLC分离效果的影响。在相同的压缩强度、装填材料、调浆溶剂等条件下，随着色谱柱的加长，柱内轴向压力分布的范围变大，柱越长，活塞与相反一端的压力差就会越大，形成的柱床越不稳定、不均匀，装填密度会越小，从而导致色谱柱产生轴向的压力梯度和密度梯度。同时，色谱柱越长，空隙率就越大。在装填过程中，一系列的塌陷主要发生在压缩开始的几秒钟内，此时，床层高度突然而迅速地降低，然后床层的降低变慢。色谱柱越长，发生局部塌陷的机会就越多，达到稳定状态的时间就越长。

目前，Prep-HPLC装填的色谱柱长度一般为100～400 mm，在满足分离度的前提下，应尽量使用较短的制备柱。具体柱子的长度和内径要根据待分离样品的性质，通过做实验反复验证进行选择。

1.4.2 色谱填料的影响

在Prep-HPLC中，填料的形状对柱子性能有很大的影响。对于球形填料，填装能迅速且平滑地达到稳定状态，对于形状不规则填料填装过程中的床层塌陷不可预测（尤其是当填料微粒较大时），装填情况非常复杂。不规则填料受压力的影响较大，当压力较大时，会有部分微粒发生破碎，从而引起柱长降低，柱压降随之变大。而且，不规则填料在整个压缩过程中都会有微粒发生破碎，这种现象与床层内压力的分布不均和微粒形成亚稳状态有关。显然，这样就无法确定床层是处于稳态还是亚稳态。如果床层处于亚稳态，任何振动都会引起进一步塌陷。当填料不规则或内孔体积较大时，要采用较小的压缩压力。用球形填料装填得到的柱长的增量与所用干填料的质量增量几乎成直线关系，而不规则微粒装填得到的柱长的增量要比干填料的质量增量大，这是因为球形微粒要比不规则微粒填装的紧密，可压缩性小。而且，微粒越大装填密度就会越小，越不稳定，越容易破碎，导致床层压降增大，柱效降低。

1.4.3 装柱技术的影响

传统的装柱法有干法和湿法装柱。在20世纪70年代，人们开始尝试动态轴向压缩装柱法（DAC）。现在DAC装柱已基本上主宰了整个制备型色谱柱市场，聊城万合工业制造有限公司生产的Prep-HPLC就是采用DAC技术，柱径为50～1 000 mm，装填的色谱柱床均匀、性能稳定、柱效高。

1.4.4 上样量的影响

Prep-HPLC为了提高柱产量，一般采用柱超载方式进行操作。提高处理量可以采用2种操作方式：一种是使用小的注入体积，但增加样品浓度，即所谓的“质量超载”；另一种是保持较小的样品浓度，但增加样品体积，即所谓的“体积超载”。在满足分离度要求的前提下，可以采用柱超载方式操作，以提高制备量。当一次操作所需要处理的样品较少时，采用“质量超载”方式更为有利；当一次操作所要处理的样品的量较多时，采用“体积超载”方式更为有利。

除上述因素外，柱子配流板形状、样品黏度、流动相流速、压缩压力等因素都会对柱效有所影响，根据经验并通过反复试验找到合适的分离方法是和每一个色谱分离工作者的勤奋工作分不开的。

2 Prep-HPLC在制药和天然产物分离中的应用

2.1 在标准品制备中的应用

市售的雌三醇试剂，考虑到一般性用途及其成本，在常规生产中不可能精制得相当纯，而免疫分析用的雌三醇标准品关系到测定样品中抗原含量的正确定量问题，要求标准品具有高纯度，无交叉物存在。杨兰萍等采用上海第十二制药厂提供的中间产品雌三醇，用制备型液相色谱制备得到雌三醇的免疫分析用标准品，在制备过程中，通过反复试验，研究了进样量、进样体积对分辨率、峰形的影响及对产品纯度的影响，总结出一套合适的制备方法，此方法制备量大，可用于研究和生产领域。

茶氨酸是影响茶叶品质的重要组成部分，约占茶叶中游离氨基酸的40%以上，占茶叶干重的1%～2%。药理学研究表明茶氨酸能拮抗咖啡碱引起的神经系统兴奋，同时具有降压作用。随着茶氨酸的保健功效逐渐为人们所认识，市场对茶氨酸的需求不断上升。目前，国内仅有少量的茶氨酸对照品，且价格昂贵，限制了对其进一步的研究和应用。肖伟涛等采用制备型高效液相色谱技术分离纯化茶氨酸对照品，纯度达到98%以上，制备收率大于80%。

2.2 在蛋白质和多肽分离制备中的应用

蛋白质和肽类药物活性强，生物功能明确，特异性高，有利于临床应用，已成为医药产业的一大类重要产品。这些产品无论是来自于生物体内还是由化学合成，往往都带有复杂的混合成分，而总目的蛋白或肽类的丰度又低，给分离纯化带来困难，需要多种方法联合使用以获得纯度满意的产品。在此过程中，Prep-HPLC通常在分离的最后阶段被用作获得高纯度产品的关键方法。

使用Prep-HPLC制备前，蛋白质和肽类样品一般先经过传统分离纯化方法，如盐析、超滤法、凝胶过滤、等电点沉淀、离子交换层析及亲和层析等，预先提高纯度，然后再进行高纯度制备。使用比较普遍的色谱柱是烷基反相键合相柱，如C18、C8及C4等，具体选择因蛋白质相对分子量或疏水性而定。流动相大多为甲醇或乙腈等有机相与水的混合体系，通常还添加三氟醋酸（trifluoroacetic acid，TFA）以增加样品的溶解度。黄鹤等用C18柱对经离子交换层析后的胸腺素α-1（T细胞免疫增强剂，为酸性较强的28肽）半纯品进行了纯化，流动相采用0.1%TFA/水和0.1%TFA/90%乙腈溶液梯度系统，可将制备前约65%的纯度提高到95%以上，回收率可达80%。韩香等报道用不同的梯度条件，最终产品纯度甚至高达98.8%以上。

2.3 Prep-HPLC在生物碱分离制备中的应用

生物碱是自然界中广泛存在的一大类碱性含氮化合物，是许多中草药的重要有效成分，在中性或酸性条件下以正离子形式存在。通常，人们用阳离子交换树脂从其提取液中富集分离生物碱。但是由于植物中含有的生物碱成分复杂、含量低，因此分离比较困难。Prep-HPLC在生物碱分离制备中应用最普遍的是反相制备方法，流动相根据样品的不同而有很大差异。

紫杉醇是从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）中提取或半合成的具有抗癌活性的二萜生物碱，属于广谱抗肿瘤药物，临床应用比较广泛。但短叶红豆杉资源珍贵，其提取物中紫杉醇的含量极低（0.000 4%～0.01%），且含有大量的植物蜡、色素和树胶等杂质，因而无论是从天然植物红豆杉中还是从培养的植物细胞组织及微生物发酵液中提取紫杉醇，都涉及到如何分离并去除与紫杉醇结构相似的其他紫杉烷类化合物的问题。制备液相是紫杉醇纯化应用中的重要手段，并有专用于制备紫杉醇的紫杉醇专用柱。Yang等将经过预处理的4 800 g云南红豆杉树皮粗提物用以D956树脂为填料的工业制备液相色谱柱（250 mm×200 mm）分离，以丙酮/水=40/60～58/42为流动相梯度洗脱，最终制备出约50 g紫杉醇，纯度达到99%，回收率在80%以上。

3 Prep-HPLC与其他分离技术的联用

3.1 Prep-HPLC与大孔吸附树脂技术的联用

大孔吸附树脂是一类不含交换基团，且具有大孔网状结构和较大表面积的高分子吸附树脂。大孔吸附树脂技术在中药化学成分的提取、分离、富集过程中具有独特的优势作用，可有效提高中药内在质量和制剂水平，降低产品的吸潮性并去除重金属残留。提取物经大孔吸附树脂处理后，可去除多糖、蛋白质及杂质，再通过Prep-HPLC分离即可得到单体化合物，使分离纯化过程更加快速、高效，大大节省溶剂的使用量。Zhang等通过大孔吸附树脂分离并富集了竹叶中的抗氧化物（AOB），再以乙腈21%乙酸水溶液（18B85）为流动相，采用Prep-HPLC从5 L的AOB浓缩液（含粗品615 g）中分离制备了荭草素（49 mg）、异荭草素（142 mg）、牡荆黄素（15 mg）和异牡荆黄素（62 mg）4种黄酮碳苷类成分。

3.2 Prep-HPLC与超临界CO2萃取技术的联用

超临界CO2萃取技术（SFE）是一种新型的提取分离技术，具有操作温度低、从萃取到分离可一步完成、CO2可循环使用且产品纯度和收率高等优点。将SFE和Prep-HPLC联用，可使天然产物中有效成分纯化过程更为环保、快速、高效。

Rochfort等采用SFE和Prep-HPLC联用技术，从3 g花茎甘蓝种子中分离得到1 716 mg萝卜苷（glucora2 phanin）。技术条件为：C18制备色谱柱（250 mm×10 mm，5μm），流动相为乙腈20%甲酸水溶液；SFE的萃取率为16%。

4 结语

Prep-HPLC是制备纯化天然产物的一种有效手段，具有产品纯度高、产率高、分离速度快等优点。其未来的发展趋势是大规模工业化生产，现在的技术已经有了很大提高，无论在设备研发还是在技术工艺开发方面都有了长足的进步。在设备研发方面，聊城万合工业制造有限公司生产的DAC制备柱和高压恒流输液泵已经能满足绝大部分用户的需求，国内有很多制药行业的研发人员也积极参与到制备工艺的研发中，通过样品的分析条件向制备条件的放大工艺也日趋成熟。

我国的天然产物分布广泛，种类繁多，对它们的组分结构与生理活性关系的研究以及对天然产物的综合利用是当今非常令人感兴趣的课题。这就要求我们对其成分的分离过程做到至纯至微，为此我们必须将各种分离手段结合起来，比如可以和大孔吸附树脂或超临界提取联合使用，并最终用高分辨率的设备将其一一分离鉴定。在此过程中，Prep-HPLC由于具有分辨率高等优点，在将来势必会成为天然产物分离方面的重要手段之一。（兴业杯参赛论文）

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