2型糖尿病大鼠肺组织凋亡相关因子Caspase表达及罗格列酮的干预作用研究

刘旭阳 ，王 绵，苏胜偶，赵春芳

（1．中国人民解放军第二五二医院内分泌科，河北 保定 071000； 2．河北医科大学第二医院内分泌科，河北石家庄 050000； 3．河北医科大学组胚教研室，河北 石家庄 050017）

近年来，随着对糖尿病并发症研究的深入，糖尿病肺部损害已经越来越受到关注。1型、2型糖尿病患者肺脏存在不同程度的限制性、阻塞性或混合性通气及弥散障碍，但发病机制尚不清楚。本研究中通过检测2型糖尿病大鼠肺组织细胞凋亡相关因子Caspase表达的变化，观察罗格列酮的干预作用，为治疗糖尿病肺病提供试验依据。现报道如下。

1 材料与试药

罗格列酮（葛兰素史克公司，批号为0308002）；链脲佐菌素（Sigma公司，批号为S－130）；盐酸氯胺酮（江苏恒瑞医药公司，批号为 KH20045）；TUNEL检测试剂盒（北京中山生物工程有限公司，批号为 10490800）；兔抗鼠 Caspase－3、Caspase－9 多克隆抗体（Santa Cruz公司，批号为 F00037626）。2周龄大鼠（体重180～250 g，河北省实验动物中心提供）；全自动生化分析仪（德国拜耳）；血糖仪（美国强生）。

2 方法与结果

2．1 试验分组

随机选取10只大鼠作为对照组，给予普通饲料喂养；选取30只大鼠，高热量饮食后给予腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ，30 mg ／kg），血糖不小于 7．8 mmol／L 者为模型组，从 12 周起每日给予同罗格列酮干预组等体积的高压消毒水灌胃；选取模型组中大鼠作为干预组，给予罗格列酮灌胃治疗[1．42 mg／（kg·d）]，至24周时进行标本收集及生化指标测定。

2．2 标本收集及生化指标测定

24周时对照组、模型组大鼠禁食12～14 h，测定血糖后，盐酸氯胺酮100 mg／kg腹腔注射麻醉，股静脉取血测定胰岛素和血脂。打开胸腔，迅速取出肺脏，冰盐水冲洗，剪除胸膜及血管，取部分肺组织置10%中性甲醛固定，脱水，石蜡包埋，常规切片留做HE染色；用TUNEL试剂盒检测肺组织细胞凋亡，棕黄色或黄色为阳性反应；下一步分别加一抗[兔抗 Caspase－3（1∶100），兔抗Caspase－9（1 ∶100）]，用 PBS 清洗后，滴加生物素标记的二抗工作液（兔抗羊），滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液（三抗），阴性对照用PBS替代一抗，观察细胞浆和／或细胞核内表达，棕黄或黄色颗粒为阳性反应。

2．3 统计学处理

采用 SPSS 10．0软件进行统计学处理，组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 q检验，所有计量资料以（X±s）表示，P＜0．05为差异有统计学意义。

2．4 结果

生化指标改变：见表1。24周时糖尿病模型组大鼠的空腹血糖、胰岛素、甘油三酯、胆固醇较同期对照组均显著升高（P＜0．05）。罗格列酮干预组大鼠甘油三酯、胆固醇下降，但无统计学意义，胰岛素明显下降，与糖尿病模型组大鼠相比，胰岛素水平有显著差异（P ＜0．05）。

表1 干预的不同阶段生化和胰岛素水平比较（X±s）

肺组织形态学变化：HE染色可见，对照组大鼠肺泡分布均匀，结构完整，由单层肺泡上皮和基膜组成，相邻肺泡之间有少量结缔组织。糖尿病模型组大鼠肺组织结构紊乱，支气管壁、肺泡壁增厚，肺泡上皮细胞显示不清，肺泡萎缩、塌陷。肺间质和血管周围细胞外基质大量增多，成纤维细胞增多，并有大量炎症细胞浸润。罗格列酮治疗组大鼠肺组织病变较糖尿病模型组明显减轻，肺间质胶原沉积较少，支气管、肺泡上皮细胞壁增厚减轻，介于对照组和糖尿病模型组之间（P＜0．01）。糖尿病模型组大鼠肺组织结构紊乱，支气管壁、肺泡壁增厚，肺泡上皮细胞显示不清，肺泡萎缩、塌陷。并有大量炎症细胞浸润。罗格列酮干预组大鼠肺组织病变较糖尿病模型组明显减轻，肺间质胶原沉积较少，支气管、肺泡上皮细胞壁增厚减轻，介于对照组和糖尿病模型组之间（P＜0．05）。见图1。

图1 大鼠肺组织HE染色（SP×200）

Caspase－3免疫组化结果：对照组大鼠的支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、少数血管内皮细胞胞核可见少量阳性表达。24周糖尿病模型组大鼠阳性表达明显增加，见于支气管细胞、肺泡上皮细胞、肺巨噬细胞及炎性细胞，胞膜及胞浆表达，阳性染色光密度值为 0．141 2 ±0．001 2，明显高于同期对照组的 0．073 8 ±0．006 5（P ＜0．01）；罗格列酮干预组阳性染色光密度值为 0．129 3 ±0．004 6，大于对照组，少于24周糖尿病模型大鼠组，组间均有明显差异（P ＜0．01）。肺组织凋亡指数对照组为 0．079 5±0．016 2，罗格列酮干预组为 0．170 9±0．014 0，糖尿病模型大鼠组为0．244 7 ±0．0123，组间比较差异有统计学意义（P ＜0．01）。见图 2。

图2 不同分组大鼠肺组织Caspase-3表达（SP×400）

Caspase－9免疫组化结果：对照组大鼠的支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞胞浆中可见少量阳性反应。24周糖尿病模型组大鼠阳性表达明显增加，见于支气管细胞、肺泡上皮细胞、肺巨噬细胞及炎性细胞，胞膜及胞浆表达，阳性染色光密度值为0．255 2±0．009 6，明显高于同期对照组大鼠的光密度值 0．083 2±0．019 2（P＜0．01）。罗格列酮治疗组阳性染色光密度值为 0．226 1±0．011 8，大于对照组，少于24周糖尿病模型组，组间均有明显差异（P ＜0．01）。见图 3。

图3 不同分组大鼠肺组织Caspase-9表达（SP×400）

3 讨论

噻唑烷二酮类降糖药物（TZDs）是一类过氧化物酶体增殖物活化受体 γ（PPAR－γ）激动剂。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR－γ）是核激素受体蛋白超家族成员。它通过连接到目标基因增强子序列上的过氧化物体增殖反应元件，调节目标基因的转录活性。罗格列酮是噻唑烷二酮类降糖药，它通过与过氧化物酶体增殖物活化受体γ结合，增加肝脏、骨骼肌及脂肪组织对胰岛素的敏感性，从而降低血糖。此外，罗格列酮还具有抗氧化、改善血管内皮功能等作用[1－2]。笔者选用罗格列酮来观察其对糖尿病肺组织凋亡的作用。

试验采用高脂高糖饮食加小剂量STZ模拟人类2型糖尿病的发病过程，建成2型糖尿病大鼠模型，分别观察不同试验组肺组织病理改变及凋亡细胞的变化。结果发现，罗格列酮治疗组大鼠空腹血糖未降低，但甘油三酯、胰岛素及胆固醇水平明显低于糖尿病大鼠组；糖尿病大鼠肺组织的病理改变明显减轻，光镜下支气管、肺泡、血管基底膜增厚减轻，肺组织结构好转。同时，罗格列酮治疗组凋亡细胞数低于糖尿病模型组，表明罗格列酮抑制了糖尿病大鼠肺组织中的细胞凋亡。

PPAR－γ在肺中分布较广，Ⅱ型肺泡上皮细胞只表达亚型PPAR － γ1，肺组织中主要表达 PPAR － γ1[3－4]。国外研究显示，PPAR－γ的激活可抑制视网膜、血管平滑肌及多种肿瘤细胞的凋亡[5]。也有研究表明，罗格列酮对糖基化终产物诱导的心肌成纤维细胞凋亡有抑制作用[6]。对于糖尿病大鼠肺组织细胞凋亡是否有抑制作用，目前国内未见报道。本研究结果显示，罗格列酮抑制了肺组织细胞凋亡，其机制尚不明确，需进一步试验研究。

[1]郭啸华，刘志华，李 恒．高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾并特点[J]．中国糖尿病杂志，2002，10 （5）：290-294．

[2]Pistrosch F，Passauer J，Fischer S，et al．In type 2 diabetes，rosiglitazone therapy for insulin resistance ameliorates endothelial dysfunction independent of glucose control[J]．Diabetes Care，2004，27（2）：484-490．

[3]Hsueh WA，Bruemmer D．Peroxisome Proliferator-activated receptor gamma：implications for cardiovascular disease[J]．Hypertension，2007，43（19）： 297-305．

[4]李惠萍，李 霞，何国钅匀，等．地塞米松对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠肺内炎性细胞的影响[J]．复旦学报：医学版，2004，31(4)：378-382．

[5]张静萍，万建华，刘国良．核因子在糖尿病大赎肺组织活性的变化[J]．中国老年病学杂志，2005，7（25）：820-822．

[6]吴 亮，朱忠华，易 烨，等．褪黑素对高糖诱导的大鼠系膜细胞凋亡的影响[J]．中国中西医结合肾病杂志，2007，9（8）：514-516．