软肝宁对大鼠肝纤维化的保护作用研究

闫 冰，周晓辉，王曙东

（中国人民解放军南京军区南京总医院，江苏 南京 210002）

肝纤维化是一切慢性肝病的病理学基础，是形成肝硬化的必经阶段[1]。因此，抗肝纤维化已成为慢性肝病的重要治疗环节[2]。软肝宁选用党参、姜黄、枸杞子、郁金、山芋肉等9味中药组方，长期应用于临床。为探讨其作用机制，本研究中通过四氯化碳致肝纤维化大鼠的影响[3]，探讨软肝宁对肝纤维化大鼠的作用机制。

1 材料与方法

1．1 材料

药物及试剂：四氯化碳（CCl4，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司，批号为110524）；秋水仙碱(昆明制药集团股份有限公司，批号为20110318）；花生油采用普通食用花生油，试验时配成20%四氯化碳花生油；软肝宁(选用党参、姜黄、枸杞子、郁金、山芋肉等9味中药组成)按人临床剂量用体表面积法换算成大鼠用量后，分别研磨配制成实验浓度，按每10 g体重0．1 mL灌胃，1次／天，用时摇匀。AST试剂盒（批号为 20110312）、ALT试剂盒（批号为 20110426）、HA试剂盒（批号为 20110409）、LN 试剂盒（批号为 20110517）、PCⅢ试剂盒（批号为20110322）、HYP试剂盒（批号为20110618）及ALB试剂盒（批号为20110322），均购自南京建成生物工程研究所。

动物：清洁级 Wister雄性大鼠 60只，体重 210～230 g，由南京江宁县汤山青龙山动物繁殖场提供，实验动物生产许可证为SCXK（苏）2010－2011。

1．2 方法

动物分组和造模方法：将60只大鼠随机分为6组，每组10只。正常对照组(A组)给予生理盐水。模型组(B组)给予20%四氯化碳花生油溶液按每10 g体重0．1 mL皮下注射，首剂加倍，每5天注射1次，首次注射后，用生理盐水按每10 g体重0．1 mL灌胃，1次／天，连续 6 周。软肝宁高、中、低剂量组(C1，C2，C3组)（0．12，0．06，0．03 g／kg）按损伤模型组同法给予CCl4造模，然后给予软肝宁给药，1次 ／天，连续给药 6周。秋水仙碱组(D组)配成 0．01 g／L按60 kg体重10 mg给药，1次／天，连续给药6周。

标本取材及预处理：各组动物在造模或给药后，以10%水合氯醛麻醉，打开腹腔，颈总动脉取血 6 mL，3 000 r／min 4℃离心15 min后，分离血清，－20℃保存待检。取肝脏，切取左侧肝脏组织约5 mm×5 mm×3 mm大小投入10%甲醛固定用作光镜观察。

1．3 观察指标

肝纤维化指标：用放射免疫法分别测定血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）与肝组织中羟辅氨酸（HYP）的含量，均按试剂盒说明书操作。

肝功能：用自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬酸氨基转移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。

常规病理学观察：将大鼠肝组织，用10%的福尔马林溶液固定，肝组织进行石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜下观察。

1．4 统计学处理

应用 SPSS 16．0统计软件，各项数据采取 X±s表示，多组数据间比较采用单因素方差分析进行处理。

2 结果

2．1 肝功能

由表1可见，模型组血清中ALT，AST及MDA的含量较正常对照组明显升高（P＜0．01），软肝宁剂量依赖性降低大鼠血清ALT，AST 水平及 MDA 的含量（P＜0．05或 P＜0．01），可提高血清中SOD含量，软肝宁组中尤以高剂量组作用更为显著（P＜0．01）。

表 1 各组 ALT，AST，MDA，SOD检测结果（X ±s，n ＝10）

2．2 肝纤维化指标

由表2可见，CCl4肝损伤模型组大鼠血清中肝纤维化各项指标及肝组织HYP水平明显高于正常对照组（P＜0．01）。与模型组比较，软肝宁高、中剂量组与秋水仙碱组可显著降低血清中HA，LN及肝组织 HYP含量（P＜0．05或 P＜0．01），而低剂量组与模型组比较无统计学意义；软肝宁高剂量组对降低LN水平及降低PCⅢ含量优于秋水仙碱组（P ＜0．01）。

表 2 各组 HA，HYP，LN，PCⅢ检测结果（X ±s，n ＝10）

2．3 肝组织病理学结果

病理切片结果表明，正常对照组肝细胞未见变性与坏死，肝内未见纤维组织增生，小叶结构清晰，肝组织正常。CCl4模型组大鼠肝组织结构镜下可见肝组织损害严重，肝小叶结构破坏，有的呈气球样变，以环中央静脉分布的肝细胞灶性或片状坏死，伴炎性细胞浸润等病理改变。软肝宁各剂量组均未出现假小叶的形成，相比较而言，中、高剂量组纤维增生较少，局限于汇管区，低剂量组疗效稍差，纤维组织又汇管区向周围延伸，变形坏死较严重；秋水仙碱可较好改善肝纤维化损伤。结果见图1。

图1 各组大鼠肝组织HE染色(×100倍)

3 讨论

肝纤维化指肝内细胞、纤维及基质的异常增生，纤维结缔组织增生的病理过程，是慢性肝病的重要病理阶段，也是发展为肝硬化的物质基础，并且是一可逆阶段，其实质是由于胶原和其他细胞外基质的合成和降解失衡，对此阶段的干预治疗处于防止肝纤维化向肝硬化转变的关键地位[4－5]。

肝纤维化的主要发生机理是由于纤维增生和纤维分解不平衡，引起肝脏纤维结缔组织过度沉积所致[6]。目前，对于肝纤维化常用的指标，仍以病理组织学检查和反映胶原代谢的指标为主。胶原纤维主要由胶原蛋白构成，而羟脯氨酸在胶原蛋白的含量约为14%，所以羟脯氨酸常被认为是胶原蛋白的特有成分，因此测定肝组织羟脯氨酸含量可间接反映肝纤维化的程度。血清中HA，LN，PCⅢ也常用于肝纤维化的诊断，其水平的高低可作为慢性肝组织炎症坏死、纤维化程度和肝纤维化、肝硬化诊断的重要指标[7－8]。因为SOD是氧自由基的清除剂，肝细胞受到自由基攻击时，SOD可因其过度消耗而减少，体内SOD活性越高，自由基清除的速度越快。在脂质过氧化反应中，MDA是其分解的终产物之一，其含量反映了机体组织、细胞损伤的程度[9]。本试验结果显示，CCl4诱导的慢性肝纤维化大鼠有明显的肝损伤及慢性肝纤维化表现。给予软肝宁治疗后，软肝宁可明显降低肝纤维化大鼠血清中ALT，AST，MDA水平及提高SOD的含量；高、中剂量还能使升高的 HA，LN，PCⅢ及肝组织中HYP水平显著降低，且病理观察提示高剂量软肝宁可以明显地抑制模型大鼠肝组织胶原纤维的增生，从而减轻肝细胞损伤，说明软肝宁对CCl4诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用。

近年来研究证实，中医中药在治疗此病方面体现出巨大的优势，成为抗纤维化领域中研究的热点之一。国内外学者致力于中医药抗肝纤维化的研究，发现中药在抗肝纤维化治疗中具有明显的优势，包括单味药，复方的研究[10－11]。软肝宁是由中药党参、姜黄、枸杞子、郁金、山芋肉等9味中药组成，能延缓四氯化碳造成的大鼠肝纤维化进程，能改善肝功能，抗脂质过氧化，并能抑制假小叶的形成及纤维组织的增生。软肝宁抗肝纤维化作用机制可能与保护肝细胞、抑制胶原合成、降低转氨酶、抗脂质过氧化反应及促进机体蛋白质合成等因素有关。

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